一、大肠癌肝转移概况
肝脏是大肠肿瘤最常见、最易发生的转移器官。据报道，美国每年新发现的大肠癌约15万人，其中1/4-1/3病例属于晚期，即TNM分期的IV期。在上述这些晚期大肠癌的病例中，发生肝转移者占50％-70％。1990年据美国癌症协会统计，当年患结直肠癌死亡的人数为6.1万，其中近4万人死于肝转移。
在初次就诊时，大约10％为Duke’s A期，20％-30％为B期，30％-40％为C期，其余则为已转移病人。其中最主要的转移器官是肝脏。大约60％的病人在第一次确诊大肠癌时就存在有转移灶。而在原发病灶手术切除后5年内，还可以有50 ％病人发生肝转移。有学者报告：大肠癌病例死亡后尸检时，肝转移可达36％-81％[3]。这种高的发生率，可能是影响大肠肿瘤总的治疗水平的一个重要因素。
关于大肠癌肝转移不经任何治疗的自然生存期，总的说来很短，平均生存期为6～10个月，中位生存期为4.5个月或6.6个月，甚至有的报道半年生存率为0[1]。上述情况充分说明大肠癌肝转移如不积极治疗，预后是较差的，是大肠癌主要死亡原因之一。
遗憾的是，绝大多数病人确诊时由于肝转移灶过大，与大血管关系密切及肝内多发转移灶等原因，只有20％左右的肝转移患者适合手术治疗[4]。据目前现状看来，单纯依靠改进手术技巧很难提高手术切除率。只有通过早期发现肝转移的存在，才有可能尽早地进行治疗，从而提高生存率，改善预后。
二、大肠癌肝转移形成的机制
大肠癌肝转移的形成是一个复杂的过程，涉及肿瘤细胞和宿主之间多因素的作用。
其转移的主要过程包括：
1、侵袭细胞外基质 在原发灶部位，癌细胞之间的粘附力降低，癌细胞表面电荷密度增加，相互排斥力增大，细胞易移动，肿瘤细胞分泌的各种酶类(如丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶)消化细胞外基质，易于与基底膜粘附连接，导致肿瘤细胞突破结缔组织构成的屏障。
2、 进入门静脉系统 癌细胞与基底膜及血管内皮细胞粘附，血管内皮细胞骨架受到影响，细胞间隙增大，在基质金属酶、肝素酶、胞浆素、弹力蛋白酶、尿激酶等作用下，癌细胞穿过血管内皮及基底膜，进入门静脉系统。
3、癌细胞在循环中存活 进入血液的癌细胞，大部分被宿主杀死，部分处于休眠状态，一小部分具有高转移潜能的细胞亚群能与血管内皮粘附，穿出管壁，形成转移灶。
4、癌细胞在肝脏内增殖 癌细胞在穿出血管后能否在一个新的微环境下生长，转移灶最终形成的关键。癌细胞只有在适宜的肝内微环境条件下微血管增殖，才能形成肝转移瘤[7]。
大肠癌肝转移的形成与癌细胞的生物学特性、机体的免疫状况及肝脏的微环境有关。只有各方面条件都满足的情况下，癌细胞才能在肝脏形成转移灶。CRC肝转移的形成可简单表示为：大肠癌原发灶-门静脉系血-肝脏-肝静脉入肺循环到全身(或入胆汁)。
三、大肠癌肝转移相关分子标志
浸润和转移得益于一些蛋白的参与，如刺激肿瘤细胞和宿主细胞或细胞外基质粘附;肿瘤细胞对宿主屏障如基底膜的蛋白水解，肿瘤细胞的定向移动，以及在靶器官内的克隆性生长。
(一)细胞粘附相关的受体的改变
1、钙粘蛋白-连接蛋白系统: β-连接蛋白(β-catenin)是一种细胞骨架蛋白，与钙粘蛋白(E-cadherin)的C端相结合，N端结合α-连接蛋白(α-cat)，形成E-cad/β-cat/α-cat复合体，由α-cat连于肌动蛋白丝[8] 。E-钙粘附蛋白/连接蛋白复合体是维持上皮细胞的极性、形态和组织结构完整的主要粘附分子。复合体功能的丧失，瘤细胞间粘附性降低，易于脱离，侵入周围组织。有研究表明β-catenin的缺失与大肠癌的肝转移相关 [9]。
2、癌胚抗原(CEA)： CEA是一种高度糖基化的细胞表面糖蛋白，为免疫球蛋白超家族成员之一，是一种肿瘤细胞的粘附分子，在大肠癌的复发转移中起重要作用,。在大肠癌肝转移的早期检测中应用最广泛[10]。肝脏Kupffer细胞上有CEA受体，并诱导Kupffer细胞分泌细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、TNFα)。可诱导肝窦内皮细胞表达细胞间粘附分子，从而增加了肿瘤粘附并滞留于肝脏[11]。
3、CD44：肿瘤细胞表面的粘附因子CD44是一种跨膜透明质酸受体，介导与内皮细胞的粘附。其变异体CD44v6、 CD44v8-10的高表达被认为与大肠癌肝转移的关系十分密切[12,13]。CD44剪接变异体可能通过促进肿瘤细胞与血管内皮细胞和细胞外基质的粘附、促进肿瘤细胞向基质侵袭，影响肿瘤细胞骨架蛋白的聚集和分布，从而影响肿瘤细胞的迁移和运动能力，几方面共同作用从而影响肿瘤转移的形成[14]。肿瘤细胞表达CD44变异体可以在转移过程中逃避宿主免疫系统的识别而免于被清除。
4、整合素(integrin)：这类分子主要介导细胞与细胞外基质(ECM)的粘附，使细胞内骨架与细胞外基质得以整合而形成整体，也参与细胞与细胞间的粘附。它主要通过识别精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽位点介导粘附作用。Takamura H等用免疫组化实验结果显示58％(11/19)存在肝转移的大肠癌组织整合素αVLA3染色阳性，较非转移组织(0％)明显增高。整合素α3β1增高，提示可能在大肠癌肝转移中起重要作用。
5、 唾液酸化的路易斯寡糖-X(Sialyl Lewis-X，sLex)抗原：SLX也是内皮性血细胞粘附分子-1(Endothelial leucocyte adhesion molecule-1, ELAM-1)的配体,作为肝血管内皮细胞表面E-selectin受体的配体，在大肠癌肝转移中起重要作用。高表达sLex抗原的肿瘤细胞由原发灶脱落，进入血管，粘附于肝血管内皮上生长，并形成肝转移瘤，更易浸润基底膜，粘附于激活的人血管内皮细胞，形成肝转移。研究证实大肠癌转移灶中sLex抗原表达强于原发灶中sLex抗原的表达[18,19]。
肿瘤相关抗原CA 19-9 和 sLex 在整个结肠都有表达。随着结肠癌从非转移性向转移性肿瘤演进时这些糖抗原也升高， sLex是结肠癌细胞趋于转移的普遍特征。某些与血清抗原相关的抗原也与肿瘤演进相关联。CA19-9抗原在腺瘤和结肠癌中的水平比正常粘膜显著为高。其他凝集素如乳糖结合性凝集素或半乳糖结合性凝集素-3(galectin-3)也与肿瘤性转化和转移演进有关[20, 21]。
(二)蛋白酶类改变
肿瘤细胞自基底膜或细胞外基质脱离，细胞蛋白酶降解基底膜或细胞外基质浸入淋巴管或血管构成浸润及转移。细胞外基质(ECM)降解蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、弹力蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等。其中金属蛋白酶家族(MMPs)被认为是一组最重要的蛋白酶，是抗肿瘤转移的一个重要靶点。在结直肠癌中研究最多的是基质金属蛋白酶和尿激酶等，
1、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteases, MMP) MMP为一金属依赖性内肽酶(endopeptidase)，对ECM中的各种成分有蛋白酶活性。由特异性金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP)和膜结合的膜型MMP(membrane-type matrix metalloproteinase，MT-MMP) 所调节。
MMP可分为以下几组：胶原酶(或明胶酶)、溶基质酶(stromelysin)、溶基质素(matrilysin)和MT-MMT。最重要的胶原酶为MMP-2 和-9, 它可水解ECM的胶原。正常结肠组织中的MMP只存在在血管中的中性粒细胞和集合淋巴小结的巨噬细胞中。在癌肿中MMP-2 和-9的量较高，并与Dukes分期相关.
2、 纤溶酶原/纤溶酶系统 纤溶酶激活物 (plasminogen activator) DeBruin等证明正常结肠粘膜尿激酶型纤溶酶激活物 (urokinase- type plasminogen activator, uPA)活性很低而组织型纤溶酶激活物(tissue- type plasminogen activator, tPA)活性却较高，但结肠癌中正好相反，结肠腺瘤中的活性则介于两者之间。
uPA表达水平与预后呈负相关，并有人证明uPA蛋白水平与肿瘤的血管生成显著相关。尿激酶型纤溶酶激活物受体(uPA受体，uPAR)在人的胃肠道肿瘤包括胃癌、胰腺癌和结直肠癌都呈高表达。uPAR表达与结肠肿瘤形成的关系仍未彻底阐明。尿激酶型纤溶酶激活物(uPA抑制物，PAI) 肿瘤中PAI-1的水平与预后呈负相关。
3、II型丝氨酸蛋白酶ST14/SNC19 为1993年从大肠癌减数杂交库中筛选得到的，具有降解细胞外基质的能力，与转移相关。并证实其作用底物为uPA及HGF/SF前体(BC-uPA及Pro-HGF/SF)，与肿瘤粘附、迁移、浸润和血管生长有关。在大肠癌研究中，癌旁粘膜ST14/SNC19表达高者淋巴结转移多。
应用Microarray技术，对比ST14转染RKO细胞前后，发现26个转移相关基因表达有差异。其中15个为促进转移基因，11个抑制肿瘤细胞转移。促进转移的基因表达上调，如生长因子、细胞粘附素、转移相关蛋白酶类、信号转导分子及癌基因等。
抑制转移基因表达下调，如Maspin、TIMP2等。这些基因的变化均可能使细胞转移能力增强。但其表达下调的基因中5个为促转移基因，表达上调的基因中7个为抑制转移基因，而有可能使转移能力减弱。这些对转移的影响尚需进一步研究证实。高表达ST14的细胞迁移能力、侵袭能力增加，促进ECM降解，共聚焦显微镜观察发现能使骨架蛋白F-actin解聚去极化。经高通过基因芯片检测，亦证实该类变化。
SNC19转染表达后表达明显上调的基因有：BRMS1、CSAP8、caveolin-1、CSF1、C-ETS2、ETV4、HPSE、IGF2、KISS1、MGAT5、、CSAP9、H-Ras、ICAM5、KAI1、MMP15、MMP16、MUC1、PIK3、PAI2、TGFA。
SNC19转染表达后表达明显下调的基因有：MMP3、MMP7、Maspin、BCSG1、Osteopontin、TIMP-2。
4、Maspin 为丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一员，是Zou等在1994年通过正常乳腺上皮与乳腺癌进行减数杂交和差异显示技术得到的。浙江大学肿瘤研究所应用mRNA差异显示分析技术，发现maspin在胃癌，及贲门癌和大肠癌配对标本中表达增高。在应用基因芯片研究时，通过对21对大肠癌和正常黏膜组织配对标本的检测，同样发现16例大肠癌中maspin表达明显升高。反义maspin转染大肠癌COLO205细胞系，大肠癌细胞出现聚集增多，粘附增强，不规则形态增多的形态学变化。研究表明：Maspin基因与大肠癌转移相关，但其作用的具体机制仍需进一步研究阐明，
5、其他蛋白酶和蛋白酶抑制物表达改变 组织蛋白酶D(cathepsin D)的表达影响癌肿细胞的浸润性。分泌的组织蛋白酶主要源自基质细胞如成纤维细胞。在结直肠癌，组织蛋白酶D在恶性细胞中也有表达，但由于其表达的变异度很大，因此与预后的关系不明确。
(三)血管生长因子
对此有协同作用。这些因子还可通过自分泌必刺激和旁分泌刺激肿瘤细胞生长。各种血管生长因子的产生对肿瘤的快速增殖和浸润生长显然是十分重要的，因肿瘤生长必需有丰富的血供b)，它们可刺激血管内皮细胞增生和产生其它形成毛细血管的因子。b-FGF和TGF-b、a(TGF-b及a结直肠癌细胞可产生血管生长素(Angiogenin)[25]/碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)[25]、转化生长因子
约100年前，发现无论是否由肿瘤细胞诱生，肿瘤内血供远较周围正常组织丰富。1971年Folkman提出肿瘤增长依赖于血液供应的观点，缺乏血流、氧份及营养物质肿瘤将呈休止状态，保持2-3mm3大小，进而凋亡[26]。血管生长因子有一系列家族成员，有瘤细胞表面存在血管生长因子相关的受体(VEGFR)。该跨膜受体结合配体VEGF即激活了酪氨酸激酶(TK)，进而导致血管内皮或/及淋巴管内皮的增生。
在VEGF家族成员中，VEGF A是血管增生的主要介质，与其相关的有VEGF B、C、D、E，并各有相关的VEGFR1、2、3及胎盘生长因子(PIGF)。VEGFR1与2位于血管内皮细胞树突样细胞及肿瘤细胞表面，VEGFR1在造血干细胞表面也可有，VEGFR3位于淋巴管内皮细胞。
VEGF除促进内皮细胞增殖，可调节内皮细胞游走，增加血管渗透性，调控免疫反应调节血管淋巴管增生。显然血管内皮细胞涉及肿瘤的发展、浸润与转移。
(四)其它转移相关分子
1、转移抑制基因nm23 nm23是Steeg从转移潜力不同的鼠黑色素 瘤细胞系中分离出来的。nm23基因可能通过丝氨酸磷酸化过程调节细胞增殖。其中nm23-H1亚型与肿瘤转移的关系更为密切[27]。人同源基因nm23-HI也定位于染色体17q21上，而这一区带在结直肠癌中经常发生杂合性丢失。在人结直肠癌中已观nm23-H1基因LOH可能是大肠癌恶性进展的晚发事件，与大肠癌严重侵袭性行为紧密相关，并由此提示nm23-H1基因可能参与了人大肠癌恶性进展及转移过程的调节[28]。然而随着研究的深入，也有相反的结论[29]。
2、PRL3基因 Vogelstein及其同事们用基因表达系列分析(serial analysis of gene expression, SAGE.)鉴定了一个在12个结肠癌肝转移中都呈高表达的磷酸酶PRL-3(phosphatase of regenerating liver-3, 又称PTP4A3Protein tyrosine phosphatase type IVA3)，而在其相匹配的同一个体的原发肿瘤中不表达。它属于新一类异戊二烯化的磷酸酶[30]。
3、骨桥蛋白(OPN) OPN是一种分泌型糖基化磷蛋白，不仅与骨组织的矿化密切相关，还与Ca2+、NO等细胞信使、巨噬细胞趋化反应、平滑肌细胞增生、肿瘤的转移及感染等多种生理、病理现象密切相关，被认为是一种新的细胞信号分子[31]。有研究表明，OPN在大肠癌肝转移组织中的表达较原发肿瘤明显增高[32]，其配体-受体之间的相互作用在促进大肠癌肝转移过程中可能发挥重要作用。丁凌等实验证明肿瘤细胞表达Osteopontin者其同质粘附降低，易于分离自原肿瘤团块脱落。而异质粘附能力增加，如血管内皮细胞间粘附增加，易于粘着于转移部位。从免疫组化观察，肿瘤组织及其周围肝组织均显阳性着色，可能于肝细胞存在其受体CD44及整合素有关。
4、细胞信号转导相关分子Rho蛋白：G蛋白中属ras超家族(即小G蛋白)约有50多个成员，可以分为Ras、Rho和Rab三个主要的亚家族。Ras蛋白主要参与细胞的增殖和信号转导;Rab参与调节细胞内膜交通;Rho蛋白(与Ras有30％同源性)对细胞骨架网络的构成发挥调节作用，从而影响细胞形态[33]。研究表明在大肠癌肝转移组织中能够检出Rho蛋白的过表达[34]。研究发现Ki-ras 第12密码子的缺陷和大肠癌肝转移潜能密切相关[35]。
虽然经过研究者的不懈努力，有更多的大肠癌肝转移相关基因和相关的分子事件正被揭示。但肿瘤相关基因相互间存在纷繁的转导、调控、抑制或激活的关联。Vogelstein等认为，数百个肿瘤相关基因相互联结成小“节”(node)及其网络，节与节的联通成为一组组的网络[45]。肝转移的发生必定涉及多个基因和蛋白的相互协同或拮抗作用,有些研究结果的相互不一致也给研究工作造成了的困惑。
五、大肠癌肝转移的分子生物学和生物信息学研究
越来越多的科学家应用系统生物学的观点，将基因组水平、转录水平和蛋白表达水平做为一个整体系统来研究，从更大、更深的层面上来理解整个生命系统。针对大肠癌肝转移，浙江大学肿瘤研究所整合染色体拷贝数变化数据来分析不同表型间基因表达谱的差异，研究染色体上特定某一段包含的基因的表达情况，从整体了解、识别大肠癌肝转移在染色体及基因组二个层次发生的分子事件，显然比仅分析基因组信息更为全面及有效。并进行了以下研究：
(1)对50例人类原发性结直肠癌的CGH分析中确定了7个染色体扩增区域和6个染色体缺失区域，其中16q的高频率缺失未见相同报道。对16q20-21区段以生物信息学方法分析，寻找到与肝转移相关的基因，并进一步以生物技术方法逐一验证，获得了相对整体的信息。
(2)应用AFFYMETRIX公司的HG-U95A芯片，对13例结直肠癌组织、12例结肠癌肝转移组织进行全基因组表达谱分析，并以9例对应的正常结直肠粘膜组织作对照。在采用相同的筛选统计算法和相同的分类方法时，整合染色体拷贝数变化数据与基因芯片数据可以使肿瘤分类准确率从36％大幅提高到95％，并获得一组大肠癌肝转移相关基因。
