慢性难愈创面目前尚无明确定义，通常可以理解为在各种内在或外界因素作用下创面不能通过正常的创面愈合进程达到愈合，进入一种病理性炎症反应状态，从而导致创面经久难愈。慢性难愈合创面是外科中长期难以解决的治疗难题，造成了较高的致残率。现有的一些治疗措施是基于普通创面模型，而非难愈创面，相关的一些基础研究也主要集中在国外，国内的研究在临床层面的较多。近些年来随着基础研究的不断深入，包括对各种细胞因子及其受体的作用和相互影响的研究，以及各种新治疗措施的应用和成熟，慢性难愈创面的治疗水平逐渐提高。本文就近年来难愈创面的发生机制及各种治疗手段如皮肤替代物、生长因子、创面负压治疗技术等的应用进展作一综述。
1、正常创面和慢性难愈创面
1.1正常创面的愈合过程
正常创面愈合过程可大致分为三个阶段：局部炎症反应阶段、细胞增殖分化阶段和组织塑型重建阶段。每个阶段由旁分泌或自分泌的细胞因子和生长因子调控。生长因子是生物体内存在的一些对细胞生长以及分化具有显著调节作用的多肽，对正常伤口愈合起到关键作用。在伤口处已发现超过 18种不同类型的生长因子，包括EGF TGF-α，FGF1-10，KGF，PDGF，IGF-1，VEGF，TGFβ1-3， IL-1α，IL-β，TNF-α，TNF-β，HIF1-α。
伤后早期纤维凝块中的血小板首先释放生长物质和细胞因子包括PDGF，从而趋化更多的中性粒细胞迁移到伤处，几天后中性粒细胞被激活的巨噬细胞替代，巨噬细胞释放PDGF，TNF-α，IL-1，IL-6等细胞因子，进一步扩大炎症反应以清除微生物和坏死组织。
炎症反应减退时，伤口液中下述的生长因子逐渐替代细胞因子：IL-1，TNF-α上调成纤维细胞KGF的表达，成纤维细胞分泌的KGF-1、2和IL-6促进角质形成细胞的迁移，并增殖分化为表皮细胞。IL-1，TNF-α，KGF，TGFβ-1诱导伤口边缘角质形成细胞合成VEGF。VEGF促进真皮内皮细胞的增殖，对新血管的形成发挥重要作用。PDGF促进成纤维细胞的增殖，诱导其合成细胞外临时基质如葡聚糖胺和纤维粘连蛋白。TNF-α上调成纤维细胞表达整合素，通过其锚定细胞到临时基质上。TGF-β强有力地刺激成纤维细胞胶原基质的合成。
在组织塑型重建阶段，胶原纤维强度增高，胶原酶或其他蛋白酶降解多余的胶原纤维，过剩的毛细血管网消退，伤口粘蛋白和水分减少。TGFβ的表达失衡会导致此阶段异常。研究表明：取自瘢痕体质病人的成纤维细胞均过量表达TGFβ1和TGFβ2。与正常成纤维细胞相比，瘢痕疙瘩中的成纤维细胞对TGFβ2的敏感性更强。
1.2难愈创面的发生机制
1.2.1难愈创面发生的分子机制
慢性创面中，成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞等组织修复细胞会出现核固缩与核染色质边缘化等典型表现。成纤维细胞是肌体修复的主要细胞，它的增殖障碍将使细胞外基质特别是胶原的合成发生障碍，其结果是创面愈合延迟。其研究主要较集中的是基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制物(TiMPs)。在难愈创面中，由于炎症介质的持续过度产生和创面大量中性粒细胞的聚集，造成难愈创面渗出液与急性创面相比其MMPs水平升高而TiMPs含量显著降低。各种炎症介质与MMPs和TiMPs的相互作用机制正在研究之中。
一种可能的机制为肿瘤坏死因子A(TNF2A)通过NF2JB通路诱导膜型12基质金属蛋白酶基因(mt12mmpgene)的表达，进而激活促2基质金属蛋白酶2(pro2MMP22)来使基质金属蛋白酶2的表达增高，而且这种效应必须要在胶原存在的情况下才能发生，TNF2A或胶原单独对成纤维细胞介导促基质金属蛋白酶2的激活几乎不起作用。此外Stojadinovic等用离体的人类皮肤进行实验，研究B2连环蛋白(B2catenin)和癌基因c2myc在难愈创面中的作用，发现难愈创面中B2连环蛋白(B2catenin)和c2myc水平呈现出过度表达，因此提出B2连环蛋白可能通过几条不同的机制抑制角质形成细胞的迁移、生长和分化，包括激活其下游的癌基因c2myc;封闭表皮生长因子(EGF)的作用;与鸟氨酸甲基转移酶(CARM21)一同作为糖皮质激素受体(GR)的共激活因子使得糖皮质激素在基因水平抑制角蛋白6/角蛋白16(Keratin6/Keratin16)的表达，进而影响细胞骨架蛋白结构。
总的来说，组织修复细胞支架改变、修复细胞过度凋亡、生长因子与靶细胞受体间信号转导。失偶联。以及多种因子间网络调节、失控、均是体表难愈性创面的发生机制。
1.2.2创面愈合出现的病理生理机制 是一个动态、有序而且复杂的过程，通常可以划分为4个相互联系、重叠的过程：出血、炎症、肉芽组织形成和组织塑型。但在各种系统或局部因素作用下，这种有序的过程被破坏，导致了慢性难愈创面的发生。造成此种破坏的因素归纳起来主要有以下5点：营养不良，组织灌注不良和缺血再灌注损伤，细菌负荷、感染和坏死组织存留，糖尿病，细胞衰老。在上述因素的影响下，创面修复能力被削弱，而以损伤因素为主导，最终导致了难愈创面的形成。
1.2.2.1 营养不良 创伤后机体对于营养和能量的需求增加，若同时伴有由血管疾病、低血容量或组织水肿引起的组织灌注不良，则出现蛋白质、能量和各种微量营养元素(通常是各种维生素、微量矿物质各种必须氨基酸如精氨酸)的绝对和(或)相对缺乏。这些均可导致创面延迟愈合或经久不愈，其机制主要包括：合成激素的合成减少，蛋白质合成速率减慢和分解加快，蛋白缺乏等导致的免疫功能低下以及感染机会的增加。营养不良不仅使患者体质量下降，而且急性的创面更倾向于变为慢性。Harris等统计，在制动和丧失去脂肪体重的的双重作用下，褥疮的发生率增加了74％。
1.2.2.2 组织灌注不良和缺血再灌注损伤 组织灌注不良在难愈创面形成中的作用已得到广泛认同，包括其引发的缺血缺氧，代谢产物堆积，以及缺氧诱发的中性粒细胞功能低下，这些都能造成创面愈合延迟。然而缺血2再灌注损伤对难愈创面发生发展的影响近年来才逐渐得到重视。Mustoe认为，在组织缺血基础上反复发生的缺血再灌注损伤也是影响难愈创面形成的重要因素之一。缺血再灌注损伤发生后炎细胞在趋化因子的作用下进入组织并释放促炎细胞因子、氧自由基等，同时N2O的含量也会降低，造成血管收缩和组织无灌流现象，加重组织损伤。衰老细胞对缺血再灌注损伤的反应性更差，这可能是为什么老年患者更容易产生难愈创面的原因之一。
1.2.2.3 细菌负荷、感染和坏死组织存留 细菌负荷、感染和坏死组织存留互为因果。创面渗液和坏死组织不仅充当细菌良好的培养基，构成细菌逃避宿主免疫反应的屏障，增加感染机会。并能释放蛋白酶类和毒素降解生长因子，侵害创周相邻正常组织，形成阻止参与创面修复细胞移动和再上皮化的物理屏障。此外由于初次清创不彻底所遗留的坏死物质(主要包括纤维蛋白、变性的胶原和弹性蛋白)，也可以通过形成纤维蛋白网对生长因子产生滞留作用，使创面愈合延缓。细菌负荷和感染都能增加炎症毒素和蛋白水解酶，延长炎症反应，增加坏死组织。需要注意的是，细菌负荷和感染不同。细菌负荷是指增殖的细菌多到足以损害创面修复，而并不一定导致感染。感染引起的合成性激素减少，分解性激素增加，感染高代谢状态和脓毒症，将会使创面愈合更加困难。
1.2.2.4 糖尿病 糖尿病患者常伴有创面血管发生迟滞、神经病变和感染，易形成难愈创面。糖尿病患者创面血管发生迟滞导致创面难愈的观点已被广泛接受，可能的机制包括NO含量失调，血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等各种刺激血管生成的生长因子含量下降。最近Maruyama等对小鼠模型的研究提示，巨噬细胞的活性及数量以及它对淋巴管形成的影响对于糖尿病创面愈合也有着至管重要的作用。神经病变使患者下肢感觉迟钝，从而更倾向于遭受反复的损伤和二次感染。陆树良等国内学者经试验后证实, 在未受到外源性损伤时，糖尿病皮肤胶原组织已有病理改变，细胞已受到某些信号的刺激而激活p53表达，诱导细胞凋亡，Bcl-2家族蛋白参与了凋亡过程的发生。
这种刺激可能源于细胞所处环境的变化，糖尿病皮肤局部组织中糖含量增高、活性代谢中间产物蓄积、活性氧自由基增多等是比较公认的病理改变，而代谢紊乱所致的细胞增殖凋亡改变参与了糖尿病肾病、神经病变、视网膜病变创面难愈的发生和发展。糖尿病皮肤组织中细胞创伤前增殖和凋亡的失衡使其创伤愈合过程有一个异常的起点，是后续创面愈合延迟的基础，研究糖尿病皮肤微环境的变化与细胞行为变化之间的相关性，能为探索糖尿病皮肤“隐性损害”及创面修复延迟的发生机制和防治手段提供一定的理论依据。此外糖尿病患者晚期糖基化终末产物对难愈创面形成的影响也颇受关注。可能的机制包括晚期糖基化终末产物(AGE)使炎症反应持续，成纤维细胞胶原沉积减少，生长因子活性降低等。
1.2.2.5 细胞衰老 细胞衰老不仅包括机体正常老化的细胞，还包括在持续暴露于慢性难愈创面渗液中衰老的细胞。有文献证实，在几种难愈创面包括褥疮、静脉曲张性溃疡中的成纤维细胞均表现出衰老的特征。衰老的细胞不但对正常的创面愈合刺激反应低下，并且占据了有限的创面空间。在正常的创面愈合过程中，这些有限的空间是由对愈合刺激反应良好的正常细胞所占据。
1.2.2.6 细菌生物膜 近期，有关细菌生物膜(Biofilms)在慢性难愈合创面形成中的作用引起了人们较大的兴趣，并认为可能是创面难愈或不愈的一个新机制。所谓的细菌生物膜实际上就是一些细菌附着并包埋于创面，与细胞外基质等形成的一种膜性结构。它由细菌及其产物、细胞外基质、坏死组织等共同组成。由于它是存在于细胞水平上的一种由多种成分构成的膜性结构，因而往往在研究中主要依靠荧光素染色等方能确定。据研究，在急性创面细菌这种生物膜的形成和作用并不明显，仅仅有6％的创面可以检测到这种生物膜的存在，因此细菌不是延缓创面愈合的主要因素。但是当创面由急性转变为慢性时，这种生物膜则可以在60％以上的创面检测到，当细菌数量达到一定程度的时候，细菌生物膜就可能起到了决定性作用。
在创面由急性转变为慢性过程中，细菌便附着于创面并在创面繁殖形成克隆，之后将自己包埋于由坏死组织、细胞外基质等形成的多层基质中，形成保护层，类似于一种膜样结构，这个时候在临床上也会观察到创面红、肿、热、痛以及氧分压低等典型表现，这样细菌就能抵抗各种治疗措施的作用。实际上这种生物膜的建立使得这些细菌能逃逸抗生素对它们的杀灭作用。一种假说认为绿脓杆菌感染创面形成的生物膜可以产生一种抵抗因子使细菌能够逃逸中性粒细胞对细菌的吞噬作用。金黄色葡萄球菌也被证明有类似的作用。
2、难愈创面的治疗进展
传统的创面治疗技术包括标准的清创包扎、削痂、创面减压和基础病变的治疗等。由于难愈创面的形成往往是多因素导致的，为提高疗效，希望治疗中能够选用有针对性的综合治疗手段。随着对难愈创面发生机制和创面愈合过程的深入了解，以及各种有效的生长因子投送技术、医用新材料和创面治疗新技术如负压创面治疗技术的应用和成熟，针对性治疗有望变为现实。
2.1 皮肤替代物的应用 常用的皮肤替代物有3种：体外培养的自体或同种异体表皮片，利用天然生物材料(同种或异种真皮)或人工合成的高分子聚合物通过组织工程学构建的真皮支架，以及两者兼有的混合皮肤替代物，主要在两方面发挥作用，即覆盖创面和促进创面愈合。有较大发展的是混合皮肤替代物，最近Gibbs等报道利用患者自身活检所取得的表皮细胞培养作为皮肤替代物，采用无细胞真皮为支架，治疗下肢慢性溃疡，取得了良好效果。混合皮肤替代物由于其血管化进程滞后于细胞长入，可导致部分长入的或播种的自体细胞缺乏血供而死亡。
解决办法之一是在替代物的基质中应用各种生长因子来促进血管化进程。以往所采用的直接将各种生长因子掺入基质中的做法，由于不能相对稳定地释放生长因子，使所掺入的生长因子大部分在病变部位被降解或结合而不能发挥应有的效应。这种情况随着借助交联剂对基质胶原进行改造而逐渐得到改善，如对胶原进行肝素化处理并负载血管内皮生长因子(VEGF)，此类方法对内皮增殖和血管化的促进作用均明显优于直接将生长因子掺入基质。Markowicz等通过动物实验提示也可通过对胶原支架进行改造，以促进真皮再生和血管化。此外还可以通过对皮肤替代物中的各种细胞进行基因改造，以持续足量释放各种需要的生长因子(将在下文中叙述)。
随着组织工程技术的发展，通过组织工程技术研制不同类型的人工皮肤报道渐多，主要有人工皮片，人工真皮替代物和人工复合全层皮肤。但人工皮片(即表皮皮片)薄，脆性和收缩性大，抗感染力差，移植后耐膜性差，易起水疱，不宜临床操作。人工真皮主要充当全层皮肤缺损创面支架，作为临时替代物覆盖创面，待创面封闭后再行自体皮片移植，其主要产品有Integra和Dermagraft系列，一般分两层，内层采用胶原纤维和硫酸软骨素构成多孔支架或种植有成纤维细胞的尼龙网孔构成多孔支架;DermagraftTM则采用可降解的聚羟基乙酸聚合物做为真皮支架。
但理想的皮肤替代产品应能将所缺失的真皮和表皮层同时修复，即所谓的全层复合皮肤，其至少包括两种细胞成分，位于表层的表皮细胞和位于真皮层的成纤维细胞。美国FDA批准应用于临床的Apligraft便是含有人体活细胞的皮肤替代品，Apligraft由活细胞和结构蛋白构成，分上下两层，模拟表皮和真皮，应用于糖尿病溃疡和静脉血运障碍导致的溃疡，明显缩短了溃疡愈合时间。
2.2 生长因子的应用 生长因子可在细胞外空间与其他分子结合或被蛋白酶降解失效，因此将生长因子直接喷、敷于创面的方法疗效欠佳。相比较基因疗法展示了良好的应用前景，它通过对参与创面愈合的细胞进行转基因处理，使之能够较稳定地合成和释放所需要的生长因子。基因疗法应当充分考虑三方面的问题：第一是如何将所需目的基因导入靶细胞中且不对机体造成损害或损害轻微;第二是要有足够的靶细胞转染率而且靶细胞中目的基因的表达量要足够产生治疗效果;最后则是对所导入基因要有良好的调控能力，使其表达能够按治疗需要维持一定的时间和浓度。可供应用的有以病毒为载体的，化学的以及机械的转基因技术，各种基因转导技术各有其优缺点，均可以在体外或体内应用。体内转基因技术避免了靶细胞的分离和培养，所需时间也短，因此更为实用。临床应用中较安全且有前景的是基因枪技术和微种植技术。
2.3 干细胞移植 目前，临床应用ESC(表皮干细胞)、骨髓MSC(间质干细胞)以及胚胎干细胞修复创面的报道日益增多。MSC促进下肢糖尿病溃疡和静脉曲张性溃疡等难愈性创面愈合已取得明显的效果，诱导胚胎干细胞分化并构建具有完整功能的组织工程皮肤的研究也在陆续开展。理论上具有分化为表皮组织潜能的细胞均可移植以行组织修复。实验证实，应用肌源性干细胞修复创面其愈合率明显高于对照组。应用干细胞治疗难愈性创面必将对创面修复的临床治疗产生深远的影响，但是目前在干细胞鉴定技术、分离培养和调控技术以及伦理(胚胎干细胞可导致活胚胎组织被破坏)等方面还存在不少问题，有待进一步研究。
2.4 氧疗的应用 2003年Cordilb等首次报道局部氧疗可加速创面的愈合，随后进行相关基础研究，提出血管断裂后的局部低氧血症是限制创面愈合的关键因素，增加感染机率。使用高压氧治疗，可提高组织内的氧分压，加速成纤维细胞增生、胶原蛋白释放、肉芽组织产生，加速上皮生长。抑制了细菌的多种代谢反应，对某些细菌有直接杀菌或抑菌作用，尤其是创面有厌氧菌感染者。Allen等发现伤口处组织的氧分压从15mmHg升至100mmHg，会使杀菌活性上升3-4倍。早期使用高压氧治疗，可促进局部血运，减轻水肿，改善受损组织缺血缺氧状态和增强抗感染能力，从而加快难愈创面的修复和愈合还使残余的瘢痕组织的数量少于预期常规治疗伤口的瘢痕。此方法不但提高治愈率，缩短病程，减少病人痛苦，还具有安全、有效和无创的特点，也可直接迅速消除创面水肿，改善局部缺氧状态，促进创面愈合。与其他治疗方法合并使用更是可以起到事半功倍的效果。
2.5 负压创面治疗技术 负压创面治疗技术是指将连接特制真空负压泵的引流管置于创面并用纱布或聚亚胺酯海绵包裹，之后用透明贴膜封闭创面，利用负压泵造成创面负压环境来进行创面治疗。相对于传统的被动引流措施，负压创面治疗是一种更为积极主动的引流手段，可将压力均匀地传导至创面，而且能够防止组织碎屑阻塞引流管。创面负压治疗技术通过多种机制促进创面愈合，包括从创面吸走渗液，减轻组织水肿，促进肉芽组织生长，保持创面湿润。但对于能否减轻创面细菌负荷，各家报道不一，还需待进一步实验证实。Braakenburg等研究指出负压创面治疗技术疗效可与一些现代创面覆盖物相媲美，既能减少患者痛苦，又可减轻医疗护理任务，对糖尿病性难愈创面尤为适用。因此负压创面治疗技术有望成为一种高效价比的难愈创面治疗手段。
