间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因是继EGFR基因突变后在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中发现的又一具有针对性靶向药物治疗的肿瘤驱动基因。针对ALK融合基因的靶向治疗药物――克唑替尼，在短短4年内即经历从临床前研究、早期临床研究到批准上市的历程，是靶点明确、检测方法成熟的靶向药物成功的典范。
然而，一如EGFR突变基础上的EGFR-TKIs治疗耐药不可避免，尽管克唑替尼在ALK阳性患者获得良好的无进展生存和客观有效率，最终还是难逃耐药而治疗失败的命运。有关ALK+NSCLC靶向治疗的耐药机制及治疗策略已经成为目前的热点。
一、ALK+NSCLC获得性耐药的机制
ALK基因重排发生于3％-7％的NSCLC，更多见于非吸烟的较年轻腺癌患者，通常与EGFR或KRAS突变的发生互相排斥。NSCLC患者ALK基因重排的发现极大改善了该类亚型患者的临床预后。克唑替尼治疗的客观有效率（objective response rate，ORR）达60％，无进展生存（progression-free survival，PFS）达8-10个月，总生存显著延长。尽管ALK+肺癌患者的获益明显，但这部分患者往往在1-2年内出现对克唑替尼耐药，且中枢神经系统的复发进展较为常见。其耐药机制是多种多样的，可分为两大类：ALK耐药突变和其他信号通路的转换（即信号旁路的激活）。
已发现的耐药机制主要有以下几种：
1、 ALK耐药突变
（1）?ALK激酶区突变：已有体外及基于患者标本的研究揭示部分ALK+肺癌患者对克唑替尼的耐药机制，其中最早明确的耐药机制是ALK激酶区突变。众所周知，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变阳性患者最主要的耐药机制是T790M突变，与之不同的是，ALK基因重排患者中已鉴定出数种ALK激酶区突变，数量上略微占优势的为L1196M，一种类似于T790M的看家基因。事实上，已在ALK激酶区鉴定出多种不同的氨基酸位点突变，包括L1196M，G1269A，S1206Y，G1202R，1151Tins，L1152R和C1156Y。Doebele等对14例经克唑替尼治疗出现获得性耐药的ALK+NSCLC患者的标本进行检测，发现三分之一患者出现了ALK激酶区的二次突变。与之相似，Katayama等对18例克唑替尼获得性耐药的患者进行临床和分子生物学特点进行分析，提示约三分之一患者出现了ALK激酶区的二次突变或ALK基因扩增，并且在体外实验中证实了这些突变导致了对克唑替尼的耐药。
耐药突变的多样性给患者和医生提出了挑战。首先，寻找能够鉴定所有已知突变的精确检测方法非常困难。其次，在出现耐药时，肿瘤组织可能具有不止一种突变。在首例公开报道的克唑替尼耐药病例的同一个肿瘤样本中即发现两种不同的突变（C1156Y和L1196M）。当肿瘤标本具有多种突变时，如果在大部分肿瘤细胞中没有一种占主导地位的突变，直接测序法可能会得出假阴性的结果。
（2）?ALK融合基因拷贝数增加：ALK融合基因拷贝数增加首次是在ALK+细胞系出现对克唑替尼耐药时发现。其后在对克唑替尼耐药的患者标本中亦发现拷贝数的增加，提示其在肿瘤细胞耐药中可能具有一定的作用。当ALK融合基因激酶区突变或拷贝数增加时，ALK信号通路往往会保留，因此预期肿瘤细胞仍具有对ALK融合基因的成瘾性。这样，更强有效的第二代ALK抑制剂也许能够克服此种细胞耐药机制。该类型耐药被称为ALK-占优势的耐药。
2、 信号旁路的激活
（1）其他信号通路的转换（信号旁路的激活）：还有一种类型被称为其他信号通路的转换（信号旁路的激活），主要是指其他信号通路出现取代了肿瘤细胞对ALK通路的依赖，导致ALK抑制剂不能充分抑制肿瘤细胞生长。该类型耐药又被称为ALK-不占优势的耐药。已鉴定出多种替代的信号通路，如：在未接受克唑替尼和已接受克唑替尼治疗的患者中均发现激活的EGFR或KRAS突变的存在。体外研究提示，EGFR和其他的HER家族受体酪氨酸激酶能够通过配体介导激活ALK受体而导致耐药。其中占第一位的信号旁路即EGFR通路，在多项研究中均有报道。在麻省总医院18例对克唑替尼获得性耐药的标本中，17例标本经免疫组织化学方法检测出EGFR磷酸化，提示存在不同程度的EGFR通路激活。更重要的是，在细胞系研究中发现，抑制EGFR可使耐药细胞系对克唑替尼恢复敏感性。第二位被激活的信号旁路是c-KIT通路。在麻省总医院18例对克唑替尼获得性耐药的标本中，2例标本经FISH方法检测发现高水平的c-KIT基因扩增。进一步通过免疫组化确认存在c-KIT过表达。另外，通过免疫组化法还发现在耐药标本实性成分的间质细胞中c-KIT配体干细胞因子（SCF）表达增加。体外实验证实c-KIT过表达需要SCF来促进其耐药，而该种耐药可通过联合伊马替尼与克唑替尼而逆转。
（2）肿瘤的异质性：当试图克服ALK+肺癌对克唑替尼的耐药性时，肿瘤异质性导致这一问题更加复杂。事实上，已在多种细胞耐药上观察到肿瘤的异质性。一个患者的标本中鉴定出两种不同的激酶区突变，而有一部分肿瘤细胞不存在突变。另外一个患者的标本同时鉴定出拷贝数增加和突变，但目前并不知道这些变异是否都存在于相同的细胞内。还有，一个患者同时进行了两个不同病灶的活检，显示出每个活检部位存在不同的分子结果。问题就不可避免的出现了：一小块活检组织的分子检测结果能否代表整个肿瘤组织，目前的有限的分子检测能否揭示所有细胞耐药的类型。这将使耐药后的分子机制的检测和制订相应的治疗策略更加复杂化。
二、克服ALK+NSCLC获得性耐药的药物与策略
1、第二代ALK抑制剂?临床前研究已证实，第二代ALK抑制剂（如CH5424802）不仅对于存在EML4-ALK融合基因的肿瘤细胞具有活性，而且对已鉴定出来的多种ALK激酶区耐药突变均具有活性。LDK378、AP26113和CH5424802的早期临床前数据提示这些药物对未接受克唑替尼治疗和克唑替尼耐药的患者均具有活性，并且每种药物均有部分数据支持其对脑转移灶有效。
LDK378是由诺华公司研发的ALK抑制剂，体外研究发现其对ALK酶的半抑制浓度（IC50）仅为0.15nM，而对照药物克唑替尼则为3nM，显示出针对ALK的较好活性。进一步在对ALK耐药细胞系研究，提示该药较克唑替尼有更好的活性。基于此，研究者设计了Ⅰ期临床研究（NCT01283516），筛选ALK阳性的经过标准治疗失败的进展期肿瘤患者入组，LDK378的剂量由50mg/d爬升至750mg/d。研究共入组131例患者，分为3组：之前接受过ALK TKI治疗的ALK+肺癌，之前未接受过ALK TKI治疗的ALK+肺癌和ALK+的除肺癌之外的其他恶性肿瘤。截止2012年11月8日，共入组130例患者，其中59例为剂量爬坡组，确认最大耐受剂量（MTD）为750mg/d；后续71例患者为MTD扩展组。接受LDK378剂量范围为400~750mg/d的114例NSCLC患者可评价疗效，ORR为58％（66例经过疗效确认，尚有20例疗效未经确认，未计算入内）。在79例对克唑替尼耐药的ALK+NSCLC亚组中，ORR为57％（45例经过疗效确认，17例疗效未经确认，未计算入内）。剩余35例未经克唑替尼治疗的ALK+NSCLC组中，ORR为60％（21例经过疗效确认，尚有3例疗效未经确认，未计算入内）。研究显示LDK378对患者中枢神经系统病灶亦有较好的疗效。在全组114例NSCLC中，中位PFS为8.6个月（95％可信区间：5.7~9.9）。最常见的不良反应（n=130）为恶心（73％），腹泻（72％），呕吐（58％）和乏力（41％），最常见的G3/4不良反应为丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高9％），门冬氨酸氨基转移酶（AST）升高（10％）和腹泻（8％）。该项研究结果表明LDK378在400~750mg/d剂量范围内显示出较强的抗肿瘤活性（无论其是否接受过克唑替尼治疗），并且对中枢神经系统病灶亦有活性；最常见的不良反应为恶心，腹泻，呕吐和乏力，且多为1或2级，患者耐受性佳。经FDA批准，LDK378正在进行多项Ⅱ期和Ⅲ期临床研究。
CH5424802是由中外制药公司研发的第二代ALK抑制剂之一，在日本进行的Ⅰ/Ⅱ期临床研究中，最大耐受剂量组共纳入46例ALK+且未接受过克唑替尼治疗的NSCLC患者，其中43例获得客观缓解（2例为CR，41例为PR），客观缓解率93.5％，CI 82％~98.6％。12/46（26％）患者发生3级以上不良反应，包括中性粒细胞减少和血液肌酸激酶含量升高。
AP26113是由阿瑞雅德制药公司研发的新型小分子靶向药物，为ALK和EGFR双靶点抑制剂，同样在早期研究中显示出针对ALK+NSCLC患者较好的疗效，客观有效率高达73％，无论之前是否接受过克唑替尼治疗。综上，第二代ALK抑制剂对于仍依赖于ALK信号通路作为驱动基因的肿瘤也许是最佳的选择。
2、合理的联合治疗或化疗?由于尚存在信号旁路激活所导致的耐药，同时应用ALK抑制剂和其他信号传导通路，有可能改善临床疗效。具有前景的策略包括：ALK抑制剂联合热休克蛋白90（HSP 90）抑制剂/MEK抑制剂/mTOR抑制剂/EGFR抑制剂。
其中一个有前景的治疗策略是利用Ganetespib药物阻断分子伴侣热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）。在体外细胞系研究中发现Ganetespib对ALK+的未经过克唑替尼处理或对克唑替尼耐药的细胞系均有活性。HSP 90抑制剂能够促进肿瘤信号通路蛋白的降解，例如ALK（涉及肿瘤细胞的增殖和存活），为克唑替尼耐药但未发生二次突变患者的患者提供了一种可能的治疗策略。一系列联合HSP90抑制剂与选择性ALK抑制剂的临床研究正在进行中（NCT 01712217和NCT01579994）。
对于ALK+NSCLC，何种化疗药物是最佳的选择，已有多项研究报道，结果显示克唑替尼对ALK+肺癌的ORR可高达65.7％（n=172），而培美曲塞方案化疗ORR仅为29.3％（n=99），多西他赛方案疗效最差，ORR仅为6.9％（n=72）。含培美曲塞的方案显示出对ALK+肺癌的较好活性，当对克唑替尼耐药的患者不能参加其他临床研究时，培美曲塞亦可作为合理的选择之一。
在EGFR突变阳性NSCLC患者对EGFR TKI耐药后的相关研究发现，立即停止EGFR TKI治疗可导致肿瘤出现“暴发性进展”或称之为“闪耀”现象，可能的原因是停止EGFR TKI治疗后，对EGFR TKI敏感的快速生长细胞再次增殖，导致肿瘤暴发性生长。与之相似，对克唑替尼敏感的ALK+NSCLC亦可能出现相似的过程。因此，当该类患者出现对克唑替尼获得性耐药时，在全身化疗同时是否需要继续克唑替尼治疗，尚无确切答案，通过一些前瞻性临床研究有助于回答这一问题。正在设计的SWOG1300研究即是针对ALK+患者出现克唑替尼耐药后随机分配至培美曲塞单药或培美曲塞与克唑替尼联合治疗组。值得关注的是，在这项研究中，如果单药培美曲塞治疗失败后，将允许患者再次接受克唑替尼治疗。基于此研究，亦能回答“在具有明确肿瘤驱动基因的患者出现获得性耐药后，两种不同的治疗模式孰优孰劣（继续原小分子靶向药物联合全身化疗vs先全身化疗，待疾病再次进展后重新“挑战”小分子靶向药物――rechallenge）”这一问题。研究结果对临床实践具有重要的指导意义，我们将拭目以待。
3、不同耐药模式的治疗策略?当具有驱动基因的NSCLC接受靶向药物治疗出现疾病进展时，应根据不同的情况制定后续的治疗策略。对于靶向药物治疗出现获得性耐药的这部分病人，一个重要的观点是认为这种耐药往往不完全，因此当疾病进展时，仍有部分肿瘤细胞能够继续被靶向药物所抑制。在更改治疗方式之前，区分出仅可检测的疾病进展与临床显著进展非常重要。这是由于某些患者虽然出现了局部的、无症状性进展，但与接受靶向治疗之前相比，肿瘤负荷仍能有较好的控制。还有些病人发现疾病进展后停用TKI，出现了疾病暴发性进展。这时予患者同一种TKI或作用于同一靶点的不同种TKI，疾病可再次获得良好控制。该现象说明TKI仍能抑制对其敏感的肿瘤细胞亚群。因此，区分不同的耐药模式对后续治疗至关重要。疾病进展仅出现于局限的一个或几个病灶时，利用局部治疗手段（如放疗、手术或射频消融治疗）同时继续克唑替尼似乎是更佳的选择。其中最具有代表性的范例即是局部脑转移的进展。患者往往除脑部病灶外，全身病灶均控制尚可，而脑转移灶进展可能是由于血脑屏障的存在，导致脑脊液中TKI药物浓度较低所致。如疾病仅仅是缓慢或非常小的进展，建议继续目前的治疗，并密切随访。如疾病出现迅速广泛进展时，说明TKI已经不能抑制肿瘤生长，建议停用靶向药物治疗。对于此类病人，再次活检可能会发现组织学改变或新的突变，有助于据此来选择有效的药物。
肿瘤驱动基因的发现及相应靶向药物的应用，极大地改善了患者的预后。然而，肿瘤细胞之固有特点必将使得治疗之路漫漫且修远，吾辈仍需上下求索！
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