光动力疗法治疗细菌和病毒性疾病

微生物（microorganisms）是指一类体积微小，结构简单，大多是单细胞的，必须用显微镜观察形态的微小生物的通称[1]。包括细菌、病毒、放线菌、立克次氏体、衣原体、支原体、螺旋体、真菌、原虫、单细胞藻类共10大类。它与人类生活密切相关，如人类疾病的发病机理，抗生素的生产，机体的免疫状态等。如何控制微生物有害方面，利用其有益方面是多年来人们一直研究的课题。目前控制微生物方法较多，本文就光动力疗法（PhotodynamicTherapy,PDT）治疗细菌与病毒性疾病作一综述。

细菌与病毒特性及其防治

细菌的特性

细菌（bacteria）是微生物的一大类群，属原核生物。有如下特点[2]：（1）种类多、分布广；（2）繁殖快、代谢强，如一般细菌20~30分钟繁殖一代；（3）个体小、作用大，光学显微镜放大40~100倍才能察见；（4）易变异，由于变异的结果使子代的特性不同于亲代，这种特性可使致病菌产生耐药性，给临床治疗带来不利影响。大部分人畜的疾病几乎都是由细菌引起的，所以它对人类的健康带来严重的危害。凡能引起人体或动物疾病的细菌称致病菌或病原菌（pathogenicbacteria）。病原菌侵入机体后，在一定的部位生长繁殖。由于双方的力量不同以及环境因素的影响，有时表现出临床症状，有时不表现出临床症状，表现为隐性传染或带菌状态。所以病原菌侵入机体后不一定都引起疾病，能否引起主要决定于病原菌的致病作用，机体抵抗力（即免疫力）和环境等三大因素。而病原菌的致病性与其毒力、侵入机体的数量以及侵入途径都有密切的关系。按革兰氏染色法，常将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。目前认为，革兰氏阴性细菌细胞壁中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，革兰氏染色过程中经脂溶剂乙醇的处理，溶解了脂类物质，结果使革兰氏阴性细菌细胞壁增加通透性，结晶紫-碘复合物亦被乙醇抽提出，于是革兰氏阴性细菌细胞被脱色，而呈复染液的红色。革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高，脂类含量低，乙醇处理中被脱水引起细胞壁肽聚糖层中的孔径变小，通透性降低，结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而呈紫色。此染色法在细菌分类、临床选药等方面有重要的意义。

抗菌常规治疗的现状

目前控制细菌主要有物理方法和化学方法。物理的消毒灭菌方法包括机械除菌法、热力灭菌法、射线照射法等。一些物理因子能够达到灭菌（sterilization）的要求即杀灭或除去所有的生命体，但它只适用于一些器械、器皿、空气等预防性消毒。对于已感染病原菌的人体基本不适用。化学方法可分为化学消毒剂和化学治疗剂。化学消毒剂的种类很多，包括：卤素、苯酚及其衍生物、醇类、烷化剂、氧化剂、重金属、表面活性剂、酸和碱、染料等，各有不同的抗菌作用。概括起来有以下几方面：（1）使微生物细胞组分氧化、水解；（2）与细胞蛋白质结合生产盐类；（3）使蛋白质凝固变性；（4）通过干扰作用使酶失活；（5）改变膜通透性；（6）使细胞破裂。化学消毒剂适用范围基本同物理消毒法，但它很少能达到灭菌要求，它们只能从物体上除去病原微生物，也就是消毒（disinfection）。它同样不适合已感染病原体的人的治疗。化学治疗剂（chemotherapeuticagents）的最大特点是选择性的杀灭或抑制细菌，对机体没有毒性或较少毒性。选择毒性小的最好例证是青霉素，它抑制细胞壁的合成，由于人体和动物细胞没有细胞壁，因而青霉素对人体无毒性。化学消毒剂则不然，如使蛋白质凝固的酚类对所有的细胞有毒，无选择性。目前化学治疗剂主要包括磺胺类、抗生素类和其它类。其机制主要是通过干扰细菌的代谢、作用于细胞壁合成、作用于核酸合成、影响蛋白质合成、干扰细胞膜功能等途径起到抗菌效果。虽然它有抑菌活性强、选择性高、抗菌谱广等特点，但使用化学治疗剂仍有四大临床问题亟待解决：毒性、过敏（变态反应）、二重感染和耐药性。其中耐药性的问题极大地影响了临床疗效。

病毒的特性

病毒（virus）属于非细胞型微生物。它是一类最小的致病因子，明显不同于其他微生物。具有以下特征[3]：（1）个体极小，是迄今所知最小的一类有生命体。（2）没有细胞结构，由核酸和蛋白质外壳构成。每种病毒只含有一种核酸：DNA或RNA。（3）严格寄生在活的宿主细胞上。不能以横分裂法进行繁殖，而是以复制方式增殖。因没有完整的酶系统，不能独立进行新陈代谢，必须依赖宿主细胞进行自身的核酸和蛋白质的合成来繁殖后代。（4）有感染性，绝大多数病毒能使人和动植物致病。据估计，人类传染病中约有75％是由病毒引起的。

抗病毒常规治疗的现状

控制病毒感染目前有两种方法：一是预防为主，广泛使用疫苗（减毒活疫苗或灭活疫苗），已有多年经验，由于病毒种类很多，且易发生变异，因此尚不能生产出各种有效的疫苗来防治各类病毒。另一是应用化学治疗剂，可惜至今还没有控制病毒的理想药物，其原因宿主细胞和病毒的关系过于密切，抗病毒作用强的药物必然对宿主细胞有很高的毒性。

PDT抗细菌治疗

目前抗菌、抗病毒治疗都存在上述一些待解决的问题，人们开始寻求新的方法进行治疗。由于细菌、病毒等微生物有象肿瘤一样生长、繁殖快的特性，于是想到了治疗肿瘤的新方法―光动力疗法（PDT）。PDT治疗肿瘤已取得了很大临床进展，目前人们在PDT治疗许多非肿瘤性疾病也获得突破，如治疗鲜红斑痣[4]、血管成型术后再狭窄[5]、类风湿性关节炎[6-9]等，PDT抗微生物治疗已在研究之中，目前主要用于防止血制品的污染，特别是病毒污染。虽然很多技术问题尚待解决，但体外研究已证明此方法可有效抗菌（包括耐药菌）、抗病毒，并可用多种光敏剂，自然的和人工合成的均可。

Bertoloni等[10]于1984年发现细菌可用PDT方法杀灭。一些研究[11-12]发现革兰氏阳性细菌比革兰氏阴性细菌对PDT敏感。有些报道[13]对革兰氏阴性细菌用大剂量光敏剂也可使其损伤，但也有报道[14]显示革兰氏阴性细菌对PDT有抵抗性，除非改变它的细胞壁的通透性。Minnock等[15]证明革兰氏阴性的大肠杆菌和绿脓杆菌与革兰氏阳性细菌一样对PDT敏感。分析这是由于革兰氏阳性和阴性细菌的细胞壁结构不同所致。

Dahi等[16]用rosebengal作光敏剂，以杀门氏菌为靶生物，用荧光反应观察rosebengal在细菌上的分布，发现其主要在膜系统上，尤其在细胞壁上，而非在细胞体内。这说明PDT抗细菌治疗原理可能是利用光敏剂选择性地潴留于细菌，主要位于细菌细胞壁和细胞膜上，激光照射时便产生单态氧和其它活性氧（ROS）直接损伤细菌细胞壁及膜系统，影响其新陈代谢，导致细菌死亡。

Schafer等[17]以rosebengal为光敏剂，以大肠杆菌、放线菌和芽胞杆菌为靶生物，发现细胞与光敏剂孵育的温度、PH值对光敏效应均有影响。芽胞杆菌作为非活跃性系统对PDT不敏感。结果提示DNA不是PDT靶目标，而细菌胞膜似乎是PDT攻击目标。Vander等[18]把副流感嗜血杆菌与ALA共同孵育，用630nm激光照射，细菌生存数显著下降，而没有加ALA的对照组细菌生存数无变化，结论为体外条件下PDT可杀灭副流感嗜血杆菌。Hillson等[19]鼠用作模型，在体PDT治疗胃肠道螺旋菌感染，显微荧光观察光敏剂分布，发现荧光最大集中在感染细菌粘膜上，包裹细菌，结果证明PDT杀灭螺旋菌的能量不能损害其下面的粘膜，结论PDT可用于杀灭粘膜上皮上的螺旋菌。

由于细菌聚在牙周形成菌斑侵害牙周粘膜，目前常用机械方法洗除菌斑，同时应用抗菌素和防腐剂。但易造成牙周机械损伤，产生耐药性和牙周组织菌群失调。Wilson等[20]证实可用PDT方法消除菌斑而不伤及正常牙周粘膜。Soukos等[21]设计试验用多聚赖氨酸（PL）与Chlorine6（Ce6）结合物作光敏剂，该结合物表面分别带正、中性、负电荷，用三种结合物分别与致口腔牙周菌斑的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌共同孵育，用671nm的红光照射，在孵育后1分钟照射红光10分钟，对革兰氏阳性菌，用带阳离子电荷的光敏剂的杀菌率大于99.99％，而不损伤粘膜上皮细胞。对革兰氏阴性菌，带阳离子电荷的光敏剂的杀菌率99％，带中性电荷的光敏剂的杀菌率91％，带阴离子电荷的光敏剂的杀菌率76％。结果提示带阳离子电荷的光敏剂PL-Ce6结合物可能在PDT治疗牙周并有很好的应用。

PDT用于骨髓移植净化

自身和同种异体骨髓移植常被用于治疗白血病和其它体液肿瘤。自身骨髓移植有几项优点，可明显避免排斥反应的危险、病毒感染和淋巴组织增生紊乱。但遗憾的是复发率高[22]。

PDT是一种体外骨髓移植净化的新技术，已有几种光敏剂被用于研究，包括DHE、BPD、CIAIPc和MC540。骨髓移植包括悬浮的单个细胞易于被光敏反应损伤。MC540已广泛被用于临床研究，此染料优先结合白血病细胞、淋巴瘤细胞和一些病毒感染的细胞。在保留多能干造血细胞50％的条件下，PDT能减少早幼粒白血病细胞达8Log[23]。净化非霍奇金氏淋巴瘤已被研究[24]，在光敏剂剂量能保证50％正常造血祖细胞情况下，MC540介导的PDT在体外试验，可降低非霍奇金氏淋巴瘤细胞4-5Log。MC540是第一种用于临床试验的光敏剂，在临床中发现它可比临床前试验用大几倍的剂量。另外，还发现MC540介导的光敏反应可抑制T和B细胞免疫[25]。因此在自身骨髓移植时可引起免疫抑制，在异体骨髓移植时能明显降低免疫排斥反应。

PDT抗病毒类疾病

第一个研究PDT治疗病毒是在噬菌体上，发现光敏剂的渗透是个可变因素。一些动物病毒，包括腺病毒和牛痘病毒，都可被PDT所抑制。有抵抗力的病毒与光敏剂一起培养，在增加病毒衣壳通透性的情况下，可对PDT变得敏感[26]。最早病人是患皮肤单纯疱疹病毒，用中性红色染料光敏剂和白光[27]。PDT抗病毒治疗仍然处于前临床研究，试用不同的光敏剂和光照射。

乳头状瘤病毒

乳头状瘤是一种快速生长的良性上皮性肿瘤，由乳头状瘤病毒引起，可变得很严重并威胁生命。通常由外科切除，但易复发并使病程延长[28]。该病在儿童和成人发病率相同。PDT已被认为是一种治疗喉乳头状瘤的有效方法。

Shikowitz等先取荷兰兔乳头状瘤病毒，接种于棉尾兔，制成乳头状瘤病毒动物模型，静脉给血卟啉衍生物（HPD），白光照射，结果肿瘤明显消退。他们[30]用DHE作光敏剂，PDT治疗荷兰兔乳头状瘤病毒介导的棉尾兔乳头状瘤动物模型。观察18个月，瘤体未复发，病变附近正常组织活检亦未见肿瘤，DNA检测未发现瘤病毒。他们[31]从1988年起用PDT治疗此喉乳头状瘤病毒病人，将81个年龄在4～74岁、病情为中度至重度的病人随机分成PDT治疗组48人和对照组33人。对照组接受常规抗病毒治疗，PDT组一半病人给DHE3.25mg/kg,另一半给DHE4.25mg/kg，在照光前48～72小时给药。经下喉镜，由氩离子泵浦染料激光输出630nm激光，能量密度为50J/cm2。结果比起对照组，PDT组瘤体明显消退，其中给DHE4.25mg/kg组更明显。

Karrer等用5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）作光敏剂，PDT治疗一个65岁妇女。患者手、上肢多处疣状损害。病史45年，曾有基底细胞癌病史，电子切片示乳头状瘤病毒感染，用20％5-ALA静脉注射，580～740nm激光照射皮损区，功率密度160Mw/cm2。PDT后，出现水疱、结痂，但很快愈合，5周后无疤痕形成，效果显著。6月后局部活检，未见乳头状瘤病毒，组织完全正常。12月后，个别皮损区有复发现象。他们认为虽然此法治疗的远期疗效尚不能肯定，但对近期治疗应为一种好方法。

Abramson等[33]用DHE作光敏剂，PDT治疗33个喉乳头状瘤病毒病人，即使最严重的病例也未复发。Feyh等[34]用HPD作光敏剂，PDT治疗21例发生在头和颈部肿瘤的喉乳头状瘤病毒复发感染患者，研究显示4年的治愈率达95％，虽然此结果令人兴奋，但PDT不能消除乳头状瘤病毒在正常组织的潜在感染。而且PDT造成常见的皮肤和生殖器损伤尚未控制。

人免疫缺陷病毒（HIV）和血源性病毒

已有一定的数据证明PDT能有效地从血液中去除致病病毒，而血中细胞和整个血液不受损伤。易感病毒包括人免疫缺陷病毒I（HIV-I）、单纯疱疹病毒（HSV）、人巨细胞病毒、猴病毒。

PDT抑制病毒的光敏剂有DHE、BPD、Aluminiumphthalocyanine和MC540。光敏抑制被认为是氧化病毒衣壳上的脂类和蛋白作用所致。MC540抗病毒机制已被研究[38,39],目前证据提示MC540介导的PDT损伤病毒衣壳，而病毒衣壳是连接病毒寄生宿主细胞的成分，决定病毒粘附和穿透宿主细胞的能力。由于这些光敏剂并不能针对病毒体内的核酸，因此，PDT对无衣壳包裹的病毒无效，如脊髓灰质炎病毒I和人腺病毒I。这些光敏剂可能不接触病毒DNA，它们不具有促有丝分裂的特性。

PDT被认为是一种用于输血前净化、消毒血液病原有机物的有希望的方法。由于其花费低、方法简单，因而受到重视。当然，一些凝血蛋白如凝血因子Ⅷ和威勒布兰特因子经PDT作用失去活性是可以接受的[40]。Mathews等[35]发现DHE和BPD介导的PDT治疗病毒污染血液没有损伤红细胞、补体和免疫球蛋白。Sieber等[36]证明MC540介导PDT杀灭病毒同时伤及了极少数红细胞、Ⅷ因子、威勒布兰特因子。自然感染病毒的血液经BPD介导的PDT后，散在血中的尚未侵袭宿主的病毒和感染病毒的白细胞被有效的杀灭，而红细胞和未感染病毒的白细胞则无损伤。

Benhur等在输血前血液用Phthalocyanines和红光行PDT，发现它可预防红细胞感染，但可能的并发症是红细胞聚集。而预先加入抗氧化剂便可预防。North等[37]发现，PDT治疗后红细胞有钾渗出和IgG抗体结合，提示可能有些红细胞损害。这项观察结合在他们试验中发现对HIV不完全的杀伤，提示用PDT作为商用消毒血或血制品可能尚有距离。然而，作为先行手段是可行的。

由于活跃的细胞对PDT敏感，而HIV仅在活跃的CD4T淋巴细胞中复制，此点利于PDT治疗。提示PDT可作为降低病人HIV的一种方法，体外对待HIV感染病人的血或白细胞，由于抑制了病毒，调节白细胞活性，可能稳定或改善免疫功能。因此PDT在此方面可能成为一种有益的治疗方法。

Benhur等以SilliconphthalocyaninePc4作光敏剂，对含感染了HIV的红细胞和淋巴细胞的血液行PDT治疗，用600～800nm的红光照射，能量密度是90J/cm2，对照过的血液进行电泳仪记录特征性DNA阶梯，可观察到在照光后30分钟出现调亡，用调亡试剂盒和流式细胞仪记录，10.5J/cm2照射后3小时，约92.5％的感染HIV的细胞出现细胞调亡，最终99％的细胞死亡。

Hebeda等观察了PDT治疗人获得性免疫缺陷综合症（AIDS）相关的卡波西肉瘤的疗效，9例同性恋患者接受治疗，按2mg/kg体重注射Photofrin，5例患者光剂量120J/cm2，余4例为70J/cm2，在治疗后3～8个月观察83处皮损区，发现疗效显著，瘤体消失。头部皮损较肢端皮损反应强，瘤体大小与反应强度成反比。但在120J/cm2组出现了较强的全身性副反应，如形成疤痕、色素沉着等。因此，他们认为PDT可治疗此病，但不宜用70～120J/cm2光剂量。

尚待解决的问题

虽然PDT治疗细菌和病毒性疾病有许多优点，但在正式用于临床之前，笔者认为也有许多问题需进一步讨论：首先，目前大量试验集中在体外培养的细菌和病毒上,个别用于动物模型和患者身上，取得了一定的疗效，但机理尚未完全阐明。到该法真正广泛用于感染细菌和病毒性疾病的患者尚有差距，还需临床观察。其次，目前的研究多针对体表或空腔脏器（如呼吸道、消化道等）内表面的感染，对于实质性器官（如肝脏等）的感染，限于目前PDT条件，尚难以解决。再次，为求治疗最佳效应，还有选择激光和光敏剂的一系列问题，包括光敏剂的选择，入径，剂量和给药时间，目前尚未找到一种最佳光敏剂。而光源的选择，照射时间，功率，程度，照射方式等不同，结果也会不同。最后，PDT造成细菌或病毒坏死后，坏死组织将释放一些炎性介质，能否造成继发性炎症，并对疾病有何影响还需观察。

小结与展望

PDT治疗细菌与病毒性疾病虽然处于临床前探索阶段，有些问题尚需解决，但该法根据细菌与病毒疾病的病理基础是细菌与病毒快速生长繁殖,侵害宿主，利用光敏剂特异性潴留于细菌与病毒的特点，充分发挥PDT治疗的优势，作为一种选择性杀伤病变组织而不伤及正常组织，方法简便，且创伤小，费用低的新型疗法有着其它疗法无法比拟的优点和发展前景。随着更新的光敏剂和更适宜的激光器的出现，PDT治疗细菌与病毒性疾病的前景将愈加光明。相信在不久的将来，它会有效地治疗众多的细菌与病毒感染患者。