肝脏疾病干细胞治疗

人体持续更新的组织如骨髓、皮肤、肠粘膜上皮等存在干细胞池，通过干细胞不间断的增殖、分化来产生成熟细胞。在肝脏，由于成熟的肝细胞仍然具备分裂、增殖的能力，肝组织内是否存在干细胞是一个长期以来颇有争议的问题。近年来随着发育生物学尤其是干细胞生物学的飞速发展，肝脏干细胞的存在及其在肝脏疾病发生中的意义越来越受到了广泛的关注。肝脏的多种病理生理过程可能与干细胞的异常增殖、分化密切相关；而肝脏干细胞的深入研究对于各种急、慢性肝脏疾病以及肝细胞癌的治疗也显示出了诱人的前景。肝脏干细胞的认识以及围绕这一特殊干细胞的相关研究已经成为现代干细胞生物学和临床医学的研究热点之一。 济南军区总医院消化内科张智高

1 肝脏干细胞的概念

1.1 胚胎肝脏干细胞 人体胚胎发育早期，前肠末端的肝憩室演化为肝部和尾部两个部分，其中肝部生长极为迅速，至胚5周时已经充填于腹腔大部［1］。这些向肝脏演化的胚胎样肝细胞我们称之为成肝细胞（Hepatoblasts），它不但具有旺盛的增殖能力，而且具有向肝细胞和胆管细胞分化的潜能［2］，所以成肝细胞实际上就是胚胎肝脏干细胞。只有前肠末端在胚胎发育中可以被诱导成成肝细胞。4个转录因子家族在肝细胞特定分化基因的表达中发挥了重要作用：①具有相同结构域的各种肝细胞核因子1（hepatocyte nuclear factor 1,HNF1）；②系列肝细胞核因子3蛋白（HNF3）；③核受体超家族；④亮氨酸拉链家族（C/EBP）。靶细胞在上述转录因子的调控下，通过特定基因的表达而产生表型的改变。

胚胎肝脏干细胞的细胞标志包括分化标志如白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）和系列细胞角蛋白（CK7，8，9，14，18，19，20),相关的干细胞因子和受体如Thy1、Flt3、SCF/ckit、OV6，髓源性干细胞标志如CD34等（表1）。Taniguchi等［3］基于上述细胞标志用流式细胞分选法（FACS）成功地对胚胎肝脏干细胞进行了分离培养，分离的胚胎肝脏干细胞向同系动物肝脏移植可以分化成肝细胞和胆管上皮细胞，表明胚胎肝脏干细胞的确具有多向分化潜能。

1.2 成体肝脏干细胞 正常肝脏是否存在干细胞尚有争议。有学者基于成熟肝细胞在肝损伤后可以不间断地恢复增殖能力的特点，提出肝脏本身就是一个“干细胞池”的观点。然而根据干细胞的定义，干细胞除了具备分裂增殖能力以外，还应具备一定的分化潜能。成熟肝细胞分裂产生的后代细胞仍然是成熟肝细胞，因此从严格意义上讲，成熟肝细胞不应被看作是干细胞。

现在认为，在胆管树的末梢区域，即相当于组织学上的郝令氏管（canals of Hering）区，存在具有双向分化潜能的上皮细胞，可能是来源于胆小管周围、体积更小的“未定性（nondescript）”间质细胞。在肝脏严重受损及/或成熟肝细胞的增殖受阻的情况下，它们可以异常激活、增殖，大量出现在肝小叶外周区域，组织学上表现为肝小叶周围体积较小、增殖活跃的细胞群体。这些细胞核质比大，胞核圆形或卵圆形，被称之为肝卵圆形细胞（hepatic oval cells,HOC）。大量增殖的卵圆形细胞沿肝实质向肝小叶中央区迁移，分化成成熟的肝细胞，修复和重建肝脏。与此同时，卵圆细胞也可以向胆管上皮细胞分化，参与肝内胆管的形成。目前普遍认为，肝卵圆形细胞就是成体肝组织内的干细胞。卵圆细胞被认为是肝脏干细胞的另外一个重要证据是，它与胚胎肝脏干细胞即成肝细胞具有相似的细胞标志，与造血干细胞具有一些共同的表面抗原（表1）。

诱导成体肝脏卵圆细胞的大量增殖有两个先决条件：其一，存在刺激肝组织再生的因素，在动物模型中常用的是大部分肝切除或毒物（如四氯化碳）引发的肝细胞坏死；其二，正常肝细胞的增殖受到抑制，动物实验中所用的抑制成熟肝细胞分裂的药物有2乙酰氨基芴（2acetylaminofluorene,2AAF）、烟曲霉毒素B1（fumonisin B1,FB1）、倒千里光碱性（retrorsine）或胆碱缺乏乙硫氨酸（cholinedeficient ethionine containing,CDE）饮食等。

干细胞不执行分化细胞的功能，其功能是通过增殖产生成熟分化的细胞。干细胞分裂产生的子代细胞只能在两种途径中选择其一：或者保持亲代特性，仍保持干细胞的身份；或者沿着特定的途径向终末分化。表1 成肝细胞、卵圆细胞、肝细胞、胆管上皮细胞及肝癌细胞的细胞标志 注：+：阳性；-：阴性；？：尚未确定1.3 肝脏干细胞的多源性和可塑性 近年来，干细胞研究领域尤为激动人心的是成年个体多潜能祖细胞（multipotent adult progenitor cells,MAPCs）的发现。肝脏干细胞可以来源于肝脏本身，但人体及动物实验均证实非肝源性干细胞可以向肝脏干细胞乃至成熟肝细胞分化。离体的骨髓多潜能祖 细胞在体外培养过程中加入特定的生长因子，即可被诱导产生有特定表型的肝干细胞和肝细胞［4］。在接受骨髓移植的病人和动物模型肝组织中可以发现带有供体基因标记的肝细胞已为若干研究所证实。不同类型组织间干细胞的横向分化也有报道，如Dabeva(1997)从大鼠胰腺组织分离出的上皮细胞移植至近交系大鼠肝脏后，发现该种细胞也可以分化成肝细胞，它们可以整合到肝小叶结构中并表达肝细胞特异性蛋白。骨髓源性祖细胞是以什么样的身份经过血液循环到达肝脏尚不明确。研究资料表明，骨髓内的细胞成分主要有造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）和内皮祖细胞（endothelial cell progenitors）。目前体内外实验证实造血干细胞（HSCs）［5］和骨髓间充质干细胞（MSCs）［6］均可以分化成肝细胞。肝脏卵圆细胞携带骨髓干细胞标记如CD34、Thy1、Fly3、SCF/ckit，尚不能说明它与造血干细胞有某种必然的联系。骨髓内的多潜能祖细胞是在不同的微环境下获得了横向分化的（transdifferentiation）能力，还是它们本身就是更为原始的多分化潜能祖细胞尚不明确。

肝脏卵圆细胞具有可塑性。卵圆细胞可以分化成胃肠道上皮细胞以及具有内分泌功能的胰腺细胞［7］；在脑组织，卵圆形细胞可以分化成神经细胞和神经胶质细胞［8］；在心脏，肝脏干细胞可以分化成心肌细胞［9］。Asakura［10］的研究发现，包括肝脏在内的若干个器官的干细胞可以分化成骨髓造血干细胞，Murase［11］对致死量照射的大鼠单纯实施肝移植后可以重建骨髓造血功能，与骨髓移植具有完全相同的救治效果。有报道在接受肝移植治疗的病人，在随后移植肝中所发现的B细胞淋巴瘤为供体起源（瘤细胞具有供体的基因标志）［12］；香港大学报道一类似病人，其移植肝中所发现的间叶样肉瘤也是供体起源［13］。Smith［14］等报道在临床肝移植伴发的移植物抗宿主反应（graftversushost disease,GVHD)中，可以发现宿主体内嵌合大量有免疫活性的供体起源的淋巴细胞。这些异常增殖的淋巴细胞和间叶细胞起源于供体肝脏的细胞来源可能有二：其一，供肝离体后尽管实施了彻底的肝脏灌注，但仍然残留了部分造血干细胞，它们是起源于供肝中残存的血液/造血干细胞；其二，如果肝脏干细胞有足够高的可塑性，它们也可能是起源于供肝中的多潜能祖细胞。

2 肝脏干细胞与肝脏疾病

2.1 肝脏干细胞与急性肝损伤 肝脏损伤后再生反应发生的非常迅速、全面（残留的肝细胞均进入增殖状态），受控于精确的调控机制（各种生长因子、细胞因子和激素的协同作用），再生的同时又可行使其正常的生理功能（如解毒、胆汁分泌、糖原合成等）。动物实验和临床研究均已证实，急性肝损伤所诱发的肝组织再生主要由残存的正常肝细胞重新进入细胞周期而完成。理论上，对于2/3肝切除的大鼠，残余的肝细胞平均经过3/2个细胞周期即可完成肝组织的再生，整个再生过程持续1~2周即可完成。临床上肝部分切除和急性肝炎所导致的肝细胞坏死可能历经与动物模型相似的再生过程。

如果成熟肝细胞的分裂增殖受到抑制，抑或肝细胞的坏死范围过大，肝脏再生就不得不通过动员干细胞的增殖来完成。在实验性肝再生模型上，可以清楚地观察到卵圆形细胞首先在肝小叶周围大量增殖，并随时间的推移逐渐向小叶内迁移。临床上，对于急性大块肝坏死的组织学观察也发现，卵圆细胞首先出现在小叶周边的界板区域，大约在肝损伤的第4天，卵圆细胞转化为肝细胞。

2.2 肝脏干细胞与慢性病毒性肝炎 在临床实践中，急性肝组织的损伤与再生实际上并不是很多见，我们所经常面临的问题是慢性肝炎所造成的反复而持续的肝细胞损伤以及在这种状态下肝细胞的代偿性增殖。

在肝细胞内，HBV病毒完成其自身的复制，甚或与肝细胞的基因组发生位点非特异性的整合。同时，病毒基因利用肝细胞的蛋白合成装置装配病毒特异性蛋白。病毒蛋白作为内源性抗原在肝细胞内加工处理后与MHCI类分子结合并被递呈至肝细胞表面，被CTL特异性识别或通过Fas系统杀伤肝细胞。假如，机体通过有效的免疫机制将病毒清除，代偿性再生完成后肝细胞不再被破坏，机体得以恢复。然而，乙型（或丙型）肝炎的特点是病毒难以被清除，肝细胞的损伤与再生反复而持续存在，尤其是感染后期，成熟的肝细胞广泛地被病毒感染，而且被病毒感染的肝细胞常常失去增殖能力（组织化学显示有病毒抗原阳性的细胞PCNA极少阳性染色），干细胞的增殖分化便成为代偿性增殖主要细胞群体。实验研究也证实，肝炎肝硬化病人，组织病理学发现在增生灶的周围有增殖状态的干细胞［15］。

肝脏干细胞主要存在于终末胆管，慢性肝炎（尤其是活动性肝炎）的组织学特点之一是汇管区及其周围的纤维结缔组织间隔出现大量的胆小管增生。尽管我们对慢性肝炎肝纤维化的机理尚未弄清，但纤维化的产生与肝脏干细胞的增殖似乎存在着某种必然的联系，病人血清高AFP水平也可能与干细胞的异常增殖有关。

2.3 肝脏干细胞与原发性肝癌 肿瘤学目前对肝细胞癌来源于成熟肝细胞的分化（dedifferentiation)，还是来源于干细胞的分化受阻（maturation arrest of stem cell differentiation）或失分化（dysdifferentiation)意见不一。

去分化观点认为，致癌物作用的靶点是成熟的肝细胞，引起靶细胞基因突变及/或遗传物质的不稳定。支持该学说的实验证据有：用逆转录病毒介导的基因转染标记成熟的肝细胞，在2乙酰氨基芴（2AAF）诱导的肝癌模型中，癌前病灶可以起源于成熟的肝细胞。对人类肝癌而言，成熟肝细胞的去分化假说似乎是一种被普遍接受的观点。目前人类肝癌的分子生物学研究主要围绕肿瘤相关基因的筛选以及病毒基因组的整合所可能引起的肝细胞基因组的突变或不稳定。

分化受阻假说认为，致癌物作用的靶点是干细胞分化成熟的微环境，各种导致该微环境结构异常及/或化学信使传递异常的因素是致癌作用的首要原因，肿瘤的本质是起源于组织内原已存在的干细胞的分化受阻［16］。我们的研究也发现，慢性肝炎组织、肝硬化组织及癌旁肝组织可以高水平表达乙肝病毒蛋白产物，但在癌组织内，病毒抗原的表达却神秘消失，被病毒感染的肝细胞常常失去增殖活性（PCNA阴性），有增殖活性的细胞常常是肝小叶周边体积较小的“卵圆形细胞”，即肝组织内的干细胞。

支持分化受阻学说的其它证据还有：肝恶性肿瘤组织内有卵圆细胞存在［17］；肝癌细胞和卵圆细胞表达相似的细胞标志如AFP，GGP，细胞角蛋白系列CK（7，8，18，19，20），转录因子OC2、OC3，卵圆细胞标志OV1、OV6，干细胞标志SCF/ckit和CD34；不少研究发现，肝癌细胞还表达B细胞分化抗原如CD10和CD40，但该抗原在卵圆细胞和成肝细胞中是否表达尚未见报道；干细胞和癌细胞都具备端粒酶活性；肝癌细胞内病毒的低复制或不复制以及病毒抗原的低表达或不表达；肝癌的多中心起源问题；体外培养的肝癌细胞系具有异质性和双向分化特性。尽管干细胞分化受阻的假说早为一些作者提出，但至今尚无直观的证据证实肝癌细胞就是来源于体内原已存在的干细胞。

3 肝脏干细胞的应用前景

目前对肝脏干细胞的研究还刚刚起步，对肝脏干细胞的分离、培养和鉴定技术还不成熟，对其与慢性肝脏病理过程以及肝癌之间的关系尚有待于进一步阐明，对成体肝脏干细胞的多源性和多向分化性的调控机制还没有弄清，但肝脏干细胞的临床应用仍显示了非常诱人的前景。

3.1 肝脏干细胞与肝功能的重建 各种原因所导致的急性和亚急性肝细胞坏死，如果肝脏的基本构架尚存，利用肝脏干细胞无限增殖的特点及其可以向肝细胞和胆管细胞分化的潜力，可望通过人肝脏干细胞移植来救治患者。

人类遗传缺陷性肝脏疾病如肝豆状核变性，有可能通过移植肝脏干细胞来取得与肝移植相似或更好的治疗效果。早在10年前Rhim等报道分离基因型正常的成年小鼠肝细胞向白蛋白尿激酶（AlbuPA)转基因小鼠移植，可以纠正转基因小鼠肝功能的缺陷，表现为无AlbuPA毒性的肝细胞增殖，最后取代基因缺陷的肝细胞。次年，该作者又报道将大鼠肝细胞移植至免疫耐受的AlbuPA转基因小鼠获得成功，大鼠肝细胞100％取代基因缺陷的小鼠肝细胞。而Overturf采用的动物模型是延胡索乙酰水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase,FAH）基因缺陷小鼠，这种小鼠发生遗传性酪氨酸血症Ⅰ型（hereditary tyrosinaemia typeⅠ，HT1）退行性肝病，他通过正常肝细胞移植来观察对其基因缺陷的纠正效果，结果发现仅需1000个肝细胞即可大部分取代原缺陷肝细胞，认为肝细胞具有类似造血干细胞的增殖潜力。然而一般认为，分化的肝细胞植入体内后增殖潜力有限，分化方向单一，而且成熟肝细胞体积较干细胞大的多，门静脉注射后不易分散到肝实质，因此还是应主张干细胞移植。在临床上，Kumar等［18］报道1例原发性淀粉样变性所致的肝衰竭经肝移植后仍然复发，肝移植10和14个月后实施干细胞移植而获得治愈。

3.2 肝脏干细胞与肝细胞癌的治疗 如前所述，肝癌的发生可能是肝脏干细胞的分化受阻，据此可以通过改善肝脏的微环境来诱导癌细胞向正常细胞分化，或者诱导癌细胞凋亡来达到治疗目的。早在10年前，Coleman［19］报道由大鼠肝脏干细胞系WBF344恶性转化的异倍体肝癌细胞株GN6TF和GP7TB向同系大鼠肝内移植，结果GN6TF未发生肿瘤，癌细胞整合到了肝实质内形成了正常的肝板；而GP7TB在肝内仍有成瘤性，但肿瘤在组织形态上分化良好。其结论是肝组织的微环境可以影响癌细胞的分化，消除或减低肿瘤细胞的恶性潜能。目前已有若干体外诱导肝癌细胞系向成熟肝细胞表型分化的实验报道，但诱导分化的分子机制及临床应用前景尚有待于进一步的研究。

3.3 肝脏干细胞与基因治疗 基因治疗是遗传缺陷性疾病乃至恶性肿瘤最有前途的治疗方法，不存在免疫排斥反应，患者无需长期服用免疫抑制药物。鉴于成熟肝细胞体外培养的限制性，将外源基因导入肝细胞较为因难，而利用干细胞则较为容易。只要宿主肝细胞生长的微环境良好，经过基因改造的肝脏干细胞或骨髓干细胞可望纠正肝脏代谢缺陷性疾病，这种基因修饰的干细胞自体移植的确显示了良好的应用前景。