抗血管生成与肿瘤治疗

尽管在近十余年来，针对肿瘤细胞的特异性靶向药物已开始进入临床试用，但因肿瘤细胞的高度异质性及分子改变的复杂性，使得其应用范围受到极大的限制。

由于实体瘤的生长和转移有赖于新生血管的形成，抗血管生成的肿瘤治疗策略从理论上讲具有抗瘤谱广、不易产生耐药及药物易于到达靶部位等特点，因此，以抗血管生成为主的肿瘤生物治疗研究成为近十多年来的研究热点。

本文将围绕肿瘤血管生成及结构特点、机体对血管生成的调节、抗血管生成的肿瘤治疗研发现状等问题进行简要阐述。

一、 肿瘤的血管生成及结构特点

肿瘤细胞是代谢活动高度旺盛的细胞，它要持续生长必需有充足的养分供应。在肿瘤发生的早期，肿瘤细胞可通过组织渗透而维持其生长，但当肿瘤直径超过1-2mm后，肿瘤必需形成提供自身营养的新生血管，否则将长期处于直径1-2mm以下的微小、休眠状态。

1、肿瘤的血管生成血管生成(angiogenesis)是指在原有微血管的基础上通过“芽生”的方式形成的新生毛细血管。正常成熟组织的血管系统是相对静止的(女性子宫内膜的周期性变化除外)，内皮细胞的更新也极为缓慢(250-300天左右)。而在肿瘤血管生成时，内皮细胞的增殖更新周期可短至数天。肿瘤血管生成是一个涉及到多种因子及细胞的复杂过程，其基本步骤可包括：

(1)局部维持血管状态的促血管生成因子和抑制血管生成因子间的平衡被打破，促血管生成因子活性上调，内皮细胞增殖;

(2)血管基底膜中的金属蛋白酶、组织纤溶酶原激活剂等多种水解酶活性上调，使基底膜与细胞外基质降解、重塑;

(3)内皮细胞表面的粘附分子表达上调，并通过激活相关途径导致内皮细胞侵入周围组织的基质层并增殖和迁移;

(4)血管内皮细胞生长因子受体表达升高，促进内皮细胞的外形重塑并形成管腔样结构;

(5)在相关基因的作用下，通过促进和松弛内皮细胞与周围支持细胞(如平滑肌细胞、成纤维细胞)等的相互作用而完成血管的形成。

肿瘤血管的形成除上述从原有血管基础上通过“芽生”的主要方式(angiogenesis)外，还存在另一种称之为血管发生(vasculogenesis)的方式。在该生成方式中，肿瘤微血管内皮细胞来源于骨髓或循环系统中的内皮细胞前体细胞(precusor)，它们可定位于肿瘤部位并在某些因子的刺激下分化为内皮细胞，并通过增殖形成血管样结构。

肿瘤组织分泌的一些因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)可促进骨髓中前体细胞的释放，促进肿瘤微血管的形成。肿瘤血管的主要生成过程虽然大体上类似于正常生理下的血管生成过程，但二者无论从结构、细胞组成及血管生成过程的时空调控均存在极大的不同。

2、肿瘤血管的结构组成与特点由于肿瘤血管的生成过程是一种失去正常控制的无序状态，与正常血管相比，肿瘤新生血管的结构缺乏完整性，管壁薄弱，缺乏平滑肌及完整的基底膜结构。内皮细胞之间存在较大缝隙，通透性强;血管网结构紊乱，有大量的血管盲端、动静脉间短路及血管的局部膨出等，导致渗出增加及组织间高压，同时也易于癌细胞穿透而形成远处转移。

近来在对肿瘤血管构成的研究中发现，在黑色素瘤及前列腺癌等肿瘤中，存在“血管生成拟态”(vasculogenic mimicry, VM)现象，它是由一种外基质构成的互相连接的环状通路，围绕在团块状肿瘤细胞的周围，肿瘤细胞存在于管壁上，并与肿瘤血管之间存在连接，用常规方法均未发现在这些管道的基质中存在内皮细胞。VM通常存在于高侵袭的黑色素瘤，肿瘤细胞容易脱落而发生血行转移。

除完全不由内皮细胞参与的“血管生成拟态”外，在肿瘤组织中还存在“马赛克血管(mosaic blood vessels)”，肿瘤细胞和内皮细胞相间排列在肿瘤血管腔的内表面，其形成可能与肿瘤血管内皮细胞间存在较大缝隙、内皮细胞脱落后血管周围的癌细胞暴露于管腔并参与血管内侧细胞层的形成有关。

肿瘤血管结构的异常及肿瘤血管细胞的构成异常增加了肿瘤血管的异质性及复杂性，这对抗血管生成的肿瘤治疗策略也是新的挑战。

二、 肿瘤血管的生成调节

肿瘤血管的生成是肿瘤细胞和血管内皮细胞通过旁分泌和自分泌的不同形式、诱发体内多种细胞因子介导产生的瀑布式反应，这种反应能否发生取决于血管生成促进因子和血管生成抑制因子间的平衡状态(即Hanahen等提出的调控血管平衡的开关系统)。

人体内存在多种促血管生成因子，如VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(bVEGF)、内皮抑素(endostatin)等，当二者间的平衡状态被打破，血管生成促进因子表达或产生高于血管生成抑制因子时，肿瘤血管开始形成。

1. 内源性促血管生成物质体内存在诸多促血管生成物质，按其生化生理特点大致可以分为肝素结合生长因子、如VEGF、FGF，非肝素结合生长因子、如转化生长因子(TGF-、)、表皮细胞生长因子(EGF)，炎性介导因子等(详见表I)。其中尤以VEGF、FGF、PDGF等肝素结合类生长因子与肿瘤血管生成的关系最为密切。

表I 内源性促血管生成物质肝素结合生长因子：VEGF、PIGF、FGF-1、FGF-2、pleiotrophin、HIV-tat、PDGF、HGF/SF 非肝素结合生长因子：TGF-、TGF-、EGF、IGF-I 炎性介导因子：TNF-、IL-8、IL-3、prostaglandin E1、E2 酶分子：PD-ECGF/TP、COX-2、Angiogenin

激素分子：Oestrogens、proliferin 寡糖分子：Hyaluronan、Gangliosides 促血细胞生成因子：EPO、G-CSF、GM-CSF 细胞粘附分子：VCAM-1、E-selectin 其它：Nitric、Oxide、Ang-1

(1) VEGF与VEGF受体 VEGF是促血管生成活性最强的生长因子，在小鼠胚胎发育期，如将VEGF基因或VEGF受体(VEGFR)基因剔除，都将因血管生成障碍而导致胚胎死亡。VEGF在肿瘤血管生成中起重要作用，许多肿瘤细胞都有VEGF的高表达。大量研究报道认为，外周血中VEGF的水平与肿瘤预后直接相关。

VEGF主要通过相应的受体KDR和Flt-1发挥作用，KDR和Flt-1均为酪氨酸激酶受体(RTK)，VEGF与KDR结合后主要通过MAPK信号通路促进内皮细胞增殖及血管生成。Flt-1的功能较为复杂，VEGF与其结合除能促进内皮细胞迁移外，还能活化基质金属蛋白酶(MMPs)，同时还能通过与VEGF的结合而对KDR活性起调节作用。肿瘤细胞VEGF表达升高同肿瘤组织缺氧产生缺氧诱导因子有关，后者能上调VEGF的表达。

内皮细胞增殖时VEGF受体表达增加。传统观念认为VEGF受体的表达是内皮细胞特异性的，但近来越来越多的研究表明，肿瘤细胞在表达分泌VEGF的同时，也可表达VEGF受体，由此产生的后果是肿瘤细胞分泌的VEGF可通过旁分泌(作用于内皮细胞)及自分泌(作用于肿瘤细胞自身的VEGF受体)途径而促进血管的生成及肿瘤细胞的增殖。

(2) 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) bFGF可通过上调内皮细胞表达和分泌胶原酶、uPA及其受体等，诱导内皮细胞的的增殖和迁移。bFGF与VEGF对促血管生成具协同效应，后者可使内皮细胞bFGF生成增多，VEGF体外促血管生成的作用及诱导纤溶酶原激活物(PA)的能力也有赖于内皮细胞产生的bFGF。

临床研究表明，许多肿瘤组织中bFGF表达升高。在肿瘤患者的尿液及血清中也可检测到较高水平的bFGF。有人认为体液中bFGF水平是判断肿瘤预后及是否复发的潜在指标。

(3) 其它促肿瘤血管生成因子如表I中所列，除上述的VEGF、bFGF外，体内还有数十种内源性血管生成因子或物质不同程度地参与了促血管生成过程，如血小板衍化生长因子(PDGF)和肿瘤坏死因子(TNF-)，它们均源自单核巨噬细胞，前者能促进内皮细胞增殖趋化、参与血管外周细胞的聚集和微血管系统的发育，后者在低剂量时可作为生长因子诱发血管的生成。

最近对轴突导向分子(Axon guidance molecules)在血管再生发生发展过程中的作用日益受到重视。轴突导向的受体和配体主要可分为四个家族：神经素(Neuropilins，NRP)/semaphorins、ephrins、eobo/Slit和netrin/Unc5。如NRP可作为VEGF异构体的受体，可通过VEGF165加强对VEGF受体KDR的激活作用，可作为VEGF信号传导通路的正性调控因子参与血管的生成，又如ephrin B2和它的受体Eph B4在动静脉血管分化中起重要作用。

最近有研究认为，Eph/ephrin的相互作用在恶性肿瘤的进展及血管再生中发挥了重要作用，可溶性Eph B4可抑制实验动物的肿瘤生长，有可能作为新的抗血管生成靶点。

2、内源性抑制血管生成物质为调节血管生成的平衡，人体内除存在许多促血管生成物质外，同时也存在多种抑制血管生成的物质，其中有相当部分来自一些蛋白质的水解片断，如来自XVIII胶原蛋白的羧基末端片断endostatin，纤溶酶原降解片断Angiostatin等(见表II)，它们大都表现出较强的抑制血管生成活性，有的已进入临床试验。

表II 内源性抑制血管生成物质蛋白片段： Angiostatin： 纤溶酶元降解片段 38KD 含Kringle区域 Endostatin： XVIII胶原蛋白的锌结合区片段 20KD AaAT： 抗凝血酶3(antithrombin 3)的片段 Vasostatin： 钙网蛋白(calreticulin)的N-端片段 10KD Protactin： 催乳素的16KD片段 PF4： 血小板因子4的N-端片段 Alphastatin: 源自纤维蛋白原的24各氨基酸小肽片断 Tumstatin： IV型胶原

3链的一个多肽片断，分子量为28KD Canstatin： IV型胶原蛋白2链的一个多肽片断，分子量为24KD Arresten： IV型胶原蛋白1链的一个多肽片断，分子量为26KD PEX： Mmp2的羟基端水解片断，分子量为20KD 可溶性介质分子： TSP-1(血小板反应蛋白-1)、Troponin I(肌原蛋白I)、IFN、 PEDF(色素上皮因子)、IP-10(胸腺嘧啶磷酸酶10)、IL-12、IL-4、 VEGI(VEGF抑制因子)、TIMP-1、TIMP -2;

PAI-1(纤溶酶元活化抑制因子-1)、 Retinoic acid、Ang、2-Methoxyoestradiol 因篇幅所限，下面仅对具代表性的内源性抗血管生成抑制物予以简单介绍，更多和更详细资料可参考相关文献。

(1)Angiostatin(血管抑素) Angiostatin由O’Reilly等于1994年从移植了Lewis肺癌小鼠的血清和尿样中分离获得，是纤维蛋白溶酶原的一个裂解片段，由肿瘤产生或活化某些蛋白酶，使纤溶酶原分解而成。在荷瘤小鼠模型中能有效抑制不同肿瘤的生长。Angiostatin抑制血管生成的机制可能主要与其下调VEGF表达、能通过与内皮细胞表面ATP合成酶;

亚单位结合使内皮细胞增殖抑制、可以降低由bFGF和VEGF诱导的细胞内的蛋白激酶erk-1和erk-2的活性等。Angiostatin常用皮下注射，有效安全剂量范围较大且尚未发现毒副作用，未表现出抗原性和细胞毒性，也无耐药性。

(2)Endostatin(内皮抑素) Endostatin是O’Reilly等于1997年首次在患内皮细胞瘤的小鼠血清中分离获得的，是大分子胶原蛋白XVIII的羧基末端非胶原区片段，由183个氨基酸残基组成，相对分子质量为20kD。其抗肿瘤血管生成作用强于angiostatin。endostatin能特异地抑制内皮细胞增生并明显抑制肿瘤的生长和转移。

用endostatin处理牛肺动脉内皮细胞可致细胞凋亡，且可明显减少抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl的产生，但在其它非内皮细胞中则未观察到这种作用，提示endostatin可能选择性地引起内皮细胞凋亡。近来研究发现，endostatin也可通过与纤维母细胞生长因子竞争及通过阻止G0/G1期向S期转变等不同途径抑制内皮细胞增殖。

endostatin除单纯使用具有抗肿瘤活性外，作为一类新型抗肿瘤药物还可以与传统的化疗、放疗联合应用，具有明显的协同作用。目前endostatin 已在不同肿瘤中进入临床试验期，并在肺癌、乳腺癌中显示出较好的疗效。我国SFDA已批准重组的endostatin作为实验性药物上市。

(3)Alphastatin Alphastatin是Carolyn等于2004年在对纤维蛋白原(fibrinogen)不同片断对血管生成活性影响的分析后发现的具抑制血管生成功能的内源性物质，由24个氨基酸组成，是现阶段发现的最小内源性肽段血管生成抑制物质。Alphastatin主要通过抑制内皮细胞的迁移和管状化而发挥抑制血管生成作用，但具体的作用机制尚不清楚。Alphastatin抑制血管生成活性强，在动物实验中，使用较低剂量即能获得很好抗肿瘤活性(0.025mg/kg/d)，有较好的潜在临床应用前景。

(4)干扰素类(TNF-//) IFN是具较显著抑制血管生成的细胞因子，可以下调多种肿瘤细胞的bFGF和VEGF的表达，从而抑制血管生成。IFN和IFN均可直接抑制人表皮微血管内皮细胞和人毛细血管内皮细胞的增殖、迁移。此外，IFN和IFN还能抑制由肿瘤细胞和淋巴细胞诱导的新生血管的形成。研究发现，IFN和IFN对bFGF表达的抑制作用具有细胞密度依赖性，而IFN的抗增殖活性作用是非细胞密度依赖性的。IFN作为抗血管生成的抗肿瘤药物已进入III期临床试验。

三、 抗血管生成的肿瘤治疗

研发现状早在一个世纪前，就有人发现肿瘤的生长常伴随有血管分布的增加，提出血管增生可能是肿瘤发生过程中的一个关键因素。二十世纪四十年代，有假设认为有源自肿瘤的促血管生长因子的存在，随后有人提出肿瘤的生长主要依赖于新生血管的观点。

二十世纪七十年代，Folkman等提出了通过抑制血管生成治疗肿瘤的设想，随后的研究随着相关工作的进展而日趋活跃，尤其在近十年中该领域的研究取得了长足的进展。2004年，第一个抗血管生成药物avastin(靶分子是VEGF的单克隆抗体)被美国FDA正式批准上市，与化疗药物联合用于治疗转移性结直肠癌，并取得了较好疗效，证实了抗血管生成在肿瘤治疗策略上的可行性。

1、抗血管生成的主要治疗靶点由于新生血管的生成是一个涉及多种细胞增殖、凋亡及细胞外基质降解及重塑的复杂过程，因此，从理论上讲，针对血管生成过程的任一环节均可能阻断血管的生成。按照抗血管生成产品的作用机制，大致可分为：

1) 血管内皮细胞抑制剂：如endostatin、angiostatin等，可抑制内皮细胞增殖，诱导其凋亡;Linomide可抑制内皮细胞迁移。

2) 血管生成因子或相关受体的抑制剂：如针对VEGF及VEGF受体的抗体，可溶性VEGF受体等，它们能通过抑制VEGF的活性而抑制内皮细胞的增殖和迁移。

3) 细胞外基质降解抑制剂：如MMPs的抑制剂能阻断MMPs的活性而抑制基质降解，进而阻断内皮细胞和肿瘤细胞的迁移和侵袭。

4) 粘附分子抑制剂：如针对一些粘附分子的抗体，能阻断内皮细胞粘附而抑制血管的形成。

5) 细胞内信号传导阻断剂：由于VEGF受体、bFGF受体等均是酪氨酸激酶受体，因子与受体结合后能活化激酶活性而引起细胞增殖等，因此，酪氨酸激酶抑制剂能通过阻断酪氨酸激酶活性阻断内皮细胞的增殖和迁移。

但酪氨酸激酶抑制剂的特异性是决定该类药物能否用于临床的关键。在上述众多的抗血管生成治疗靶点中，以针对VEGF及VEGF受体的靶点治疗最为引人关注。这是因为VEGF及VEGF受体在血管生成中的作用最为重要，同时二者在许多肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞中均有高表达，因此是抗血管生成的相对最为理想的靶点，目前除VEGF抗体药物已批准进入临床外，其它许多针对VEGF及受体的药物也处于不同的临床试验中。

2、抗血管生成的临床试验目前有许多抗血管生成抑制剂在进行临床试验，详情可浏览网站：http://www. cancer.gov/clinicaltrials/developments/anti-angio-table。当前，以VEGF的抑制因子在临床上取得的进展最快，VEGF抗体avastin是唯一一种由美国FDA批准在临床上使用的抗肿瘤血管再生药物。

FDA批准avastin上市前进行了大型、随机、双盲的临床Ⅲ期试验，在这个试验中avastin作为一线用药，与blous-IFL化疗联合应用于结肠直肠肿瘤患者。在试验中与仅使用IFL+安慰剂组相比，blous-IFL与avastin联合治疗组患者的中位总体生存时间由15.6延长至20.3个月。

与此同时，无恶化生存期、药物效应率和疗效持续时间均有提高。虽然病人对avastin有较好耐受，但有2％的患者发生胃肠穿孔或刀口的愈合障碍。另外对于65岁以上的患者，相对于单独使用化疗，并发动脉栓塞的可能性增加两倍。发生这些反应的机制尚不明确，人们猜测可能是细胞毒性药物破坏了血管，而阻断VEGF则加剧了这种破坏。

avastin用于非小细胞肺癌、肾细胞癌、转移性乳腺癌治疗的Ⅲ期临床试验也正在进行中。除avastin外，其它VEGF抑制剂也正在进行临床试验。许多针对VEGF受体的靶向性小分子药物，如SU11348和Baf43-9006均已获得重要进展。

SU11348能抑制VEGFRs、PDGFR、C-kit和Flt-3的活性，有报道称，SU11348在治疗耐受imatinib的胃肠肿瘤中取得明显疗效。Baf43-9006最初被认为是一种raf激酶抑制剂，后来的研究提示它也可以抑制VEGFR的活性。在对于晚期肾细胞癌患者的Ⅲ临床试验结果表明，单独使用Baf43-9006可以使患者无进展生存期显著延长。 AG-01376 有与SU11348相似的抑制激酶活性的作用。

在将其单独使用治疗转移性肾细胞癌的Ⅱ期临床试验中，有效率达46％。 PTK787也是一个VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。它与FOLFOX4化疗方案联合治疗结肠癌患者已进入临床Ⅲ期。通过对用PTK787治疗的患者的调查评估，它对无进展生存时间的提高具有统计学意义。

具有较强抗血管生成活性的内源性多肽endostatin的重组药物，在2005年已被我国SFDA批准上市，用于肿瘤的实验性治疗。研发中的各类主要抗血管生成产品及作用机制见表III。