早期子宫颈癌进展过程中VEGFR-3/Flt-4的作用(转载)

VEGFR-3，又称Flt-4，其作为VEGF-C/D的酪氨酸激酶受体，除主要表达于淋巴管内皮细胞以外，在肝、脾血窦、创伤修复以及肿瘤组织新生的血管内皮中也有表达。江苏省中西医结合医院妇产科马小平

最近的研究结果表明，肿瘤细胞本身也存在VEGFR-3表达，并以多种方式参与了恶性肿瘤的进展。本研究采用免疫组织化学SP法检测早期子宫颈癌组织中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3/Flt-4的表达，同时检测VEGFR-3/Flt-4标记的脉管密度(MVD)，分析其与临床病理因素的关系，探讨VEGFR-3/Flt-4在早期子宫颈癌中进展过程中所起的作用。

1、材料与方法

1.1 研究对象

选择手术切除的子宫颈癌组织41例，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。术前未行放化疗，术后病理证实。临床分期按照国际妇产科联盟(FIGO,2000)标准，其中Ⅰa期7例，Ⅰb期14例，Ⅱa期20例;组织学分级：G17例，G2 13例，G3 21例;组织学类型鳞状细胞癌37例，腺癌4例;有淋巴结转移者15例，无淋巴结转移者26例;患者年龄26～70岁，中位年龄42岁，绝经后12例，绝经前29例。镜下淋巴管管腔内查见癌细胞为淋巴管浸润，无淋巴管浸润者35例，有淋巴管浸润者6例。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫组织化学SP法染色

采用免疫组化SP试剂盒，严格按说明书操作。组织蜡块5μm连续切片;二甲苯常规脱蜡、水化;微波抗原热修复(95℃,10min)，抗原修复液为枸橼酸缓冲液(pH 6.0);3%过氧化氢-甲醇溶液10min阻断内源性过氧化物酶;10%山羊血清封闭非特异性抗体;滴加一抗：兔抗人多克隆抗体VEGF-C(1∶50，ZA-0266);兔抗人多克隆抗体VEGF-D(1∶100，BA1461);兔抗人多克隆抗体VEGFR-3(1∶200，ab27278)，孵育60min;滴加抗兔生物素化二抗，孵育30min;滴加辣根过氧化物标记链亲和素，孵育30min;DAB镜下显色，苏木素复染，中性树胶封片。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，已知乳癌切片作为阳性对照。

1.2.2 结果判定

VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3/Flt-4阳性染色为细胞质呈现棕黄色颗粒。参照Jüttner等报道的方法，按照阳性细胞所占的比例分为：-(无阳性细胞)，+(0-5%阳性细胞)，++(5%-50%阳性细胞)，+++(50%阳性细胞)。其中++―+++判定为阳性表达;MVD参照Weidner等报道的方法，低倍镜下寻找阳性管腔密集区域即“hot spot”区，高倍镜观察并计数，以5个高倍镜视野阳性管腔的平均数表示MVD。

1.3 统计学处理

所有数据资料采用SPSS13.0统计软件进行处理。计量资料MVD采用± s表示。P0.05 为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 VEGFR-3在早期子宫颈癌组织中的表达

VEGFR-3/Flt-4除表达于淋巴管内皮细胞上以外，部分血管内皮细胞也有表达。形态学上VEGFR-3/Flt-4阳性脉管部分为血管，部分为淋巴管。阳性脉管周围部分炎性细胞也可见VEGFR-3/Flt-4蛋白表达(图1A)。VEGFR-3/Flt-4阳性脉管主要分布于肿瘤组织周围间质中(图1B)。部分VEGFR-3/Flt-4阳性脉管内可见癌细胞(图1C)。肿瘤细胞中可见VEGF-C、VEGF-D、 VEGFR-3/Flt-4蛋白表达，其表达阳性率分别为48.7%(20/41)、58.5%(24/41)、63.4%(26/41)(图1D、E、F)。

图1 VEGFR-3/Flt-4在早期子宫颈癌组织中的表达

2.2 早期子宫颈癌组织中VEGFR-3/Flt-4蛋白、MVD与临床病理因素及相关蛋白表达的关系

VEGFR-3/Flt-4蛋白表达与子宫颈癌患者月经状态、组织学分级、组织学类型无关，与临床分期、淋巴结转移、淋巴管浸润及VEGF-C、D蛋白相关;MVD与月经状态、组织学分级、组织学类型、淋巴结转移、淋巴管浸润均无关，与临床分期及VEGF-C、D蛋白相关。

表1早期子宫颈癌组织中VEGFR-3/Flt-4、MVD与临床病理因素及VEGF-C、D蛋白表达的关系

3、讨 论

由于具有促血管或促淋巴管生成特性，血管内皮生长因子家族VEGF-A、B、C、D、E及其受体VEGFR-1、-2、-3在促进恶性肿瘤生长、转移过程中的作用机制及相应的基因治疗策略，一直以来都是研究的热点。目前研究认为肿瘤血管生成主要受VEGF-A/VEGFR-2的调控，而肿瘤淋巴管生成主要受VEGF-C、D/VEGFR-3调控。本研究结果显示VEGFR-3/Flt-4除表达于淋巴管内皮细胞上以外，部分血管内皮细胞也有表达。形态学上VEGFR-3/Flt-4阳性脉管部分为血管，部分为淋巴管。VEGFR-3/Flt-4标记的阳性脉管密度MVD与临床分期及相关蛋白VEGF-C、D均相关，而与月经状态、组织学分级等其他临床病理因素无关。这与Yasuoka等研究结果不同。其机制可能是VEGFR-3/Flt-4在肿瘤淋巴管生成和血管生成过程中均发挥了重要的调控作用。肿瘤细胞分泌VEGF-C、D，以旁分泌的形式作用于淋巴管内皮细胞或血管内皮细胞上的酪氨酸激酶受体VEGFR-3/Flt-4，介导内皮细胞的增殖、分化与管腔形成。一方面肿瘤组织内增多的血管为肿瘤细胞提供生长所必需的营养物质，另一方面肿瘤组织内增多的淋巴管为肿瘤细胞浸润转移提供通道，有利于肿瘤细胞转移扩散。但由于缺乏真正意义上的淋巴管内皮标志物，组织内不同类型、不同部位甚至不同发展阶段的淋巴管其内皮细胞标志物也不尽相同，因此VEGFR-3/Flt-4在肿瘤血管生成和淋巴管生成中的确切作用机制有待深入研究。

VEGFR-3/Flt-4作为VEGF-C/D的受体，除主要表达于内皮细胞以外，最近的研究结果表明许多肿瘤细胞本身也存在Flt-4的表达，并在肿瘤进展过程中发挥了重要作用。对人类许多恶性肿瘤的临床研究表明，肿瘤细胞中VEGFR-3/Flt-4的表达与患者临床分期、细胞分化程度、淋巴结转移以及患者预后相关。Van等研究发现在从子宫颈上皮内瘤变进展为子宫颈浸润癌的过程中，VEGFR-3/Flt-4表达不同，因此推测其可能参与了宫颈癌变过程中的促淋巴管生成表型的转变。体外迁移和侵袭试验研究结果显示，某些具有强侵袭能力的肿瘤细胞，如子宫颈癌细胞系SiHa、乳腺癌细胞系MDA-MB-231、Hs578T，除表达VEGF-C外，还存在Flt-4的表达，人重组体VEGF-C蛋白(Cys156Ser)能够促进肿瘤细胞迁移和侵袭能力，而应用重组体Flt-4/Fc 封闭VEGF-C的受体VEGFR-3/Flt-4后，细胞迁移和侵袭能力大大下降。Masood等研究则认为VEGFR-3/Flt-4有促进恶性间皮瘤生长的作用。Dias等研究表明VEGFR-3/Flt-4还可能参与了白血病细胞的增殖，存活以及化学耐药形成。本研究结果表明在子宫颈癌组织中，肿瘤细胞VEGFR-3/Flt-4的表达与患者淋巴结转移、淋巴管浸润和临床分期相关，并且与其配体VEGF-C、D蛋白表达相关。其机制可能是肿瘤细胞分泌VEGF-C、D，以自分泌的形式作用于肿瘤细胞自身上的VEGFR-3/Flt-4，促进肿瘤细胞迁移和浸润，从而导致肿瘤淋巴管浸润和淋巴结转移，参与肿瘤进展。但由于VEGF-C/D作用受体在不同肿瘤细胞中存在异质性，除VEGFR-3/Flt-4外，VEGF-C/D受体还有VEGFR-2、NRP-1和NRP-2等，因此研究究结果也有不一致的地方。Jüttner等研究结果认为胃癌细胞VEGFR-3/Flt-4的表达与患者淋巴结转移无关。此外，本研究结果还显示，在肿瘤组织周围间质中，部分炎性细胞也可见VEGFR-3/Flt-4蛋白表达，但其作用还不清楚。有研究显示，在肿瘤淋巴管生成的过程中，肿瘤组织间质中的炎性细胞也可能发挥了重要的作用。

由此我们可以推测，VEGFR-3/Flt-4在子宫颈恶性肿瘤进展过程所起的作用可能是多方面的，不同肿瘤类型其作用也可能不同，其确切机制仍待进一步研究。