结核疫苗的研究策略与进展

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性消耗性传染病，严重威胁人类健康和生命。据世界卫生组织(WHO)估计，如果不能有效控制结核病，2000年至2020年将有10亿人感染结核分枝杆菌，2亿人发展为结核病，3500万人死于该病。结核分枝杆菌高水平的潜伏感染以及与HIV的合并感染，给结核病的预防、诊断和治疗带来了很大困难。

卡介苗是法国科学家Camille Guerin和Albert Calmette将牛结核分枝杆菌强毒株在体外长期培养开发出的减毒活疫苗，1921年开始应用于人类，已有超过30亿人接种。目前，卡介苗仍作为唯一的结核疫苗在发展中国家广泛使用。虽然卡介苗在预防结核上做出了重要贡献，如有效帮助儿童预防结核等传染病的发生，但是也存在很多问题，如卡介苗对成人肺结核的免疫保护存在较大争议，保护率为0-80％，一般为40％～60％。另有研究表明，在事先接触过环境分枝杆菌或接种过卡介苗的人群中，卡介苗被机体既存的免疫应答所阻断，从而导致免疫失败，因此，卡介苗只对既未感染过分枝杆菌又未接种过卡介苗的人群有效。

因此，结核分枝杆茵影响人类健康以及卡介苗存在的诸多问题使结核新型疫苗的研发十分紧迫。

一、结核疫苗的研究策略与进展

目前结核疫苗研究主要有两个方向，一是改造现有的卡介苗，例如开发重组卡介苗;二是开发有效的新型疫苗，例如构建亚单位疫苗(包括蛋白多肽、DNA疫苗)和以病毒为载体的疫苗等。

单独用一种结核疫苗免疫一次通常不足以产生较好的免疫保护作用。因此，在初次免疫的基础上，用相同或不同的疫苗进行加强免疫以达到增强免疫效果的目的，即初始一加强免疫策略。该策略对提高结核疫苗的免疫效力尤其对提高成人肺结核的免疫保护力意义非凡。该策略可分为同源初始一加强免疫策略(用同一种疫苗进行初始与加强免疫)和异源初始一加强免疫策略(用不同种疫苗进行初始与加强免疫)。据报道，异源初始一加强免疫策略较同源初始加强免疫策略能引起更高效的细胞免疫应答，很可能成为未来结核疫苗免疫接种的最理想方式。应用于异源初始加强免疫策略中的结核疫苗选择方案主要有两种，以DNA疫苗作初始免疫，以病毒载体疫苗进行加强免疫;以卡介苗作初始免疫，以亚单位疫苗进行加强免疫。目前研究的结核疫苗主要有重组卡介苗、蛋白多肽疫苗、DNA疫苗和活载体疫苗等。

1、重组卡介苗：虽然卡介苗在儿童中安全有效，但是在成人中免疫保护性争议较大。以提高卡介苗的成人免疫保护力为目标，研究者做了大量工作，例如将编码结核免疫优势抗原或免疫刺激细胞因子的基因导入卡介苗中构建重组卡介苗，有效地增强卡介苗的免疫保护效果。另外，由于接种的卡介苗被吞噬细胞吞噬后易于吞噬体中持续存在，处于不活动状态，削弱其对免疫细胞的刺激作用，从而影响免疫应答强度。因此，构建促使卡介苗从吞噬体中释放的重组卡介苗也是提高免疫力的一种措施。有学者构建了一种重组表达PfoA的卡介苗，PfoA能促使吞噬体瓦解，将重组卡介苗释放到细胞质，增强对CD8+T淋巴细胞刺激作用，从而提高细胞免疫应答水平。

但重组卡介苗的研究面临一个难题，即一般细菌的表达系统不能在卡介苗中很好地发挥基因表达功能，为构建卡介苗的表达载体带来很大困难。为解决该问题，对结核分枝杆菌的转录信号做了很多研究，为了解结核基因的转录、表达和结核分枝杆菌启动子与其他细菌的差异性以及解决表达问题提供良好基础。用含有结核分枝杆菌启动子的表达载体构建的重组卡介苗，能高效表达一些免疫优势抗原，例如Ag85A、Ag85B、Ag85C、6×103早期分泌靶抗原蛋白(ESAT6)等。此外，在卡介苗中重组表达IFN和IL-12等细胞因子，可提高免疫应答水平，但也有研究结果表明，局部细胞因子过高反而会造成机体的病理性损伤。

目前进入临床试验的重组卡介苗有重组表达Ag85A疫苗(r卡介苗30)和重组表达李斯特菌溶解素，尿素酶缺陷型卡介苗(VPM 1002)c9]。虽然r卡介苗VPM 1002在美国已完成Ⅰ期临床试验，且开发者表示该疫苗有良好的免疫耐受性和免疫原性，但目前还无令人振奋的结果出现。

2、蛋白多肽疫苗：蛋白多肽疫苗不仅有良好的安全性，而且能特异性地诱导CD4+Th1细胞和CD8+细胞毒T淋巴细胞活化，是较为理想的疫苗形式之一。抗原的选择和佐剂的应用可能对其开发起决定性作用。

作为候选疫苗的蛋白或多肽是从免疫优势抗原中筛选出来的，包含人T淋巴细胞识别表位，主要为结核分枝杆菌的分泌蛋白和细胞壁成分，例如ESAT-6、Ag85、MTB39和MTB32等。单一抗原由于抗原谱窄，不足以引起有效的免疫保护，因此，将多个抗原混合或融合表达是提高疫苗免疫保护的措施。研究表明，融合蛋白比多个抗原混合物能更有效地诱导出免疫保护，但机制尚不清楚，可能与抗原稳定性以及摄取和传递效率有关。另有研究表明，多种抗原之间可能存在相互竞争，从而降低疫苗的免疫原性和免疫保护性。因此，在设计多组分抗原疫苗时，单一抗原和混合抗原的免疫效果有必要分开考察。

蛋白多肽疫苗需要有效的佐剂辅助才能诱导产生理想的免疫应答，不同佐剂可引起不同类型的免疫应答，因此，寻找合适的佐剂是开发蛋白多肽疫苗需要解决的重要问题。相关研究目前已取得了一些进展，如细菌毒素、细胞因子、脂质体和CpG DNA等都在实验动物中表现出较好的免疫增强效应。

目前进入临床试验的蛋白多肽疫苗有，以IC31为佐剂的Ag85B和ESAT-6混合肽(Hybrid 1-IC31)、以CAF01为佐剂的Ag85B和ESAT-6混合肽(Hybrid1-CAF01)、MTB39和MTB32的融合蛋白(M72)和Ag85B和TB10.4的融合蛋白(Hybrid 4/AERAS 404-IC31)，这些疫苗都被用作加强免疫疫苗，前两种也有望成为首剂接种疫苗，佐剂的联合使用，增强了这些疫苗的免疫效果。M72疫苗的临床试验结果初步表明，该疫苗在成人中安全有效，不良反应轻微，免疫应答可持续6个月。

3、DNA疫苗：DNA疫苗是指将编码某种抗原蛋白的重组质粒载体导人宿主体内，通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，从而使宿主获得对该抗原的免疫力，以达到预防和治疗疾病的目的。DNA疫苗在动物模型中可诱导抵抗多种病毒、细菌和寄生虫等病原体的免疫保护作用以及抗结核的CD4+和CD8+T淋巴细胞免疫应答。

该疫苗的优点在于：

①细胞内生成的抗原易于被主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子呈递，可激活CTL和Th;

②免疫应答较持久;

③稳定，易制备和储存;

④不诱导针对载体的免疫反应，可用于重复加强免疫;

⑤对免疫缺陷的宿主使用安全。另外，DNA疫苗可对CD4+T淋巴细胞缺失的小鼠提供很好的保护作用，这为HIV阳性的结核易感高苊人群的免疫策略提供参考。

尽管DNA疫苗可以不用佐剂，但佐剂可明显提高DNA疫苗的免疫效果，减少疫苗的用量和免疫次数，在蛋白多肽疫苗中使用的佐剂几乎都被尝试用于DNA疫苗，并取得了一些进展。

已有多种结核DNA疫苗可诱导小鼠产生有效的免疫保护，例如ESAT-6、Ag85A/B、Mtb 8.4、Mtb 41、MPT 39、MPT 63、MPT64、MPT 83和hsp65等。但DNA疫苗的保护作用一般仅为相同实验条件下卡介苗的50％～80％，可通过多种DNA疫苗联用或构建多种抗原的表达载体来提高其保护能力。另外DNA疫苗对大型哺乳动物的免疫原性普遍较差，可能由质粒在体内转染效率低所致。采用体内电击法、无毒细菌或病毒作为载体等方法可增强其免疫原性。

4、活载体疫苗：活载体疫苗利用对机体安全的微生物作载体，在体内持续表达结核特异性抗原，具有经济、高效的优点，此外，活载体还有一定的佐剂作用。常用的活载体有痘病毒载体、腺病毒载体等。该类疫苗通常应用于加强免疫中，增强T淋巴细胞免疫应答。活载体疫苗缺点在于机体既存的免疫应答可阻止该免疫抗原反应，从而减弱疫苗功效;另外，这类疫苗有时因机体对活载体的免疫反应限制了再次免疫的效果。

目前，进入临床试验的活病毒载体疫苗有重组修饰的表达Ag85的Ankara痘病毒载体疫苗A(OxfordMVA85A/AERAS 485)，表达Ag85A、Ag85B和TBlO.4的复制缺陷的腺病毒载体35疫苗(AERAS 402/CrucellAd35)和表达Ag85A的复制缺陷的腺病毒载体5疫苗(AdAg85A)，这些疫苗均被设计为增强卡介苗和重组卡介苗的加强免疫疫苗。Oxford MVA85A/AERAS 485已被证实在不同人群中有良好的安全性和免疫原性。AERAS402/Crucell Ad35可诱导CD4+和CD8+T淋巴细胞应答，且无严重不良反应发生。

5、其他结核疫苗：热灭活的牝牛分枝杆菌(M-vaccae)是一种来源于环境分枝杆菌的疫苗，含有结核分枝杆菌的许多抗原。在坦桑尼亚接种过卡介苗的HIV感染者中已完成Ⅲ期临床试验。耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)疫苗是耻垢分枝杆菌的全细胞提取物，与结核分枝杆菌有共同抗原，由中国药品生物制品检定所开发，Ⅰ期临床研究结果证实该疫苗无明显不良反应。

另外，卡介苗突变株对抑制吞噬体的成熟有一定作用，能更有效地进行抗原加工与提呈，增强免疫保护，Callewaert等构建了1株卡介苗突变株，在小鼠中免疫保护效果比卡介苗更好，且有较高的安全性。

二、结核疫苗开发存在的问题

1、缺乏免疫保护相关的检测指标：大部分上市疫苗的临床保护力可通过替代终点检测，例如通过检测疫苗诱导的抗体水平来判断疫苗免疫保护力，但是，在结核疫苗的免疫保护上未找到相关指标。尽管研究已确认CD4+和CD8+及其他T淋巴细胞在结核感染及免疫后可产生不同类型的细胞因子，且近年来一些新的免疫分析技术被用于鉴定和量化检测分泌特定细胞因子的T淋巴细胞应答上，但是，这些研究仍未发现某种特定细胞或细胞因子应答与自然感染或免疫保护间存在相关性。

2、缺乏合适的动物模型：不同动物模型对同一结核候选疫苗的评价结果有所不同。Reed等研究发现，一种结核特异性抗原在小鼠和豚鼠上取得较好的免疫效果，但在非人类的灵长动物上却以失败告终。因此，现有动物模型证实有免疫保护的结核疫苗并不能保证其在人体中有良好的免疫保护作用。

3、缺乏经济、灵敏和特异的结核诊断方法：结核疫苗的有效性试验基于临床终点。目前广泛应用的结核临床诊断方法有结核菌素皮肤试验和细菌培养等，但这些方法存在特异性差、无法检出潜伏感染等缺点;荧光定量PCR的诊断方法虽然灵敏，但也不能检出潜伏感染;IFN-γ体外释放试验可有效解决该问题，但由于结核主要流行于发展中国家，成本较高而限制其推广。因此，构建经济、灵敏和特异的结核诊断方法对评价疫苗临床保护十分必要。

4、HIV感染：所有疫苗的开发都面临一个重要问题，即对HIV感染人群的安全性和有效性，这也是结核的高危人群。据WHO估计，全世界至少有600万人同时患肺结核和AIDS。在一些非洲国家，肺结核是AIDS患者最主要的死亡原因。接种卡介苗可致其感染，存在很大的不安全性，因此，这也成为新型结核疫苗开发的又一重大挑战。

三、展望

近年来受HIV感染、免疫抑制剂的广泛应用、耐多药结核病流行和人口老龄化等因素影响，结核发病率和病死率大幅回升，给结核的预防、诊断和治疗带来了很大困难。天花的成功消灭提示，疫苗是彻底消灭某种传染病的有效办法。WHO基于新型结核疫苗研究进展制定出到2050年全世界彻底根除结核病(每百万人少于1例)的目标。在2009年至少有6种结核候选疫苗完成了Ⅰ期临床试验，现有3种疫苗正在进行Ⅱ期临床试验，其中大部分被开发作为卡介苗的加强免疫疫苗。据WHO估计，在2014年至2015年间将有一种新型结核疫苗被批准上市，希望储备充足财力和产品，以满足疫苗上市即能迅速达到高覆盖率的目标。随着基因组学以及蛋白质组学的发展，对结核分枝杆菌的发病机制和抗感染免疫应答的认识也不断深入，为研究更经济有效的结核疫苗提供理论基础，以从容应对严重威胁人类健康的结核病。