纵隔肿瘤首先应进行影像学诊断，通过影像可初步诊断，如畸胎瘤、胸腺瘤、心包囊肿、纵隔囊肿等疾病，以上患者通过影像学基本可以确诊。但鉴别肿瘤良、恶性时，需进行穿刺检查。
肿瘤穿刺方式较多，如经皮穿刺、经胸腔镜辅助穿刺甚至纵隔肿瘤切除后行病理检测确诊。纵隔镜可辅助诊断纵隔疾病，包括淋巴结肿大、纵隔肿瘤。如通过上述检查未能确诊，医生可通过微创技术，如纵隔镜、胸腔镜、气管镜等行气管纵隔穿刺，包括经皮穿刺检查，以明确诊断。
