腹腔穿刺术的操作步骤，首先要签知情同意书，让患者了解穿腹腔穿刺的目的、意义和相关的方法。对病人的腹腔进行定位，常规的消毒，铺无菌单，消毒的范围是以穿刺点为中心，大约15cm，再有就是对病人穿刺点进行局部的麻醉。
如果病人的穿刺点周围有伤口，应该尽量避避开这个伤口，再有就是用针对穿刺点进行穿刺，边进针、边抽吸。如果有腹腔积液流出或者看到腹腔积血，这时候需要进行标本的留取，同时进行进一步的检查来明确诊断，或者是应用急诊手术的方式探查腹腔，来查找原发病。
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