单肺通气（OLV）是胸科手术一种特殊的机械通气模式，然而它在使两侧肺分别通气，为手术提供便利条件的同时也不可避免地会产生一些不良反应。在临床麻醉工作中，OLV引起的肺损伤越来越受到重视，但OLV所致肺损伤的发病机制尚未阐明。近年来，细胞凋亡在肺组织损伤中起着重要的的作用，有研究认为在机械通气的早期就有肺泡上皮细胞凋亡的发生[1]，而对OLV过程中肺组织细胞凋亡的研究少见报道。本实验旨在研究OLV时肺组织细胞凋亡指数及凋亡执行因子Caspase-3的表达，分析其变化与OLV所致肺损伤的关系。广西医科大学附属肿瘤医院麻醉科黄冰
材 料 与 方 法
动物分组 健康SD雄性大鼠42只，体重200～250g(由广西医科大学实验动物中心提供)。分成空白对照组(C组)，双肺通气对照组(B组), 单肺通气组(A组)。C组为自主呼吸组，A组和B组分别分成三个亚组：A1组（OLV 0.5h，恢复通气0.5h），A2组（OLV 1h，恢复通气0.5h），A3组（OLV 1.5h，恢复通气0.5h）和B1组（双肺通气1h）,B2组（双肺通气1.5h）,B3组（双肺通气2h）。大鼠随机分配，每组6只，共七组。
模型制备 A组大鼠予氯胺酮80mg/kg，速眠新Ⅱ0.6～0.8ml/kg肌肉注射实行麻醉，行气管切开并插入自制气管导管至主气管，给予维库溴铵2mg/kg，待呼吸渐微弱，接呼吸机(江湾Ⅰ型微型动物呼吸机)进行机械通气，通气参数为：氧浓度(FiO2):100％，潮气量（VT）:10ml/kg,呼吸频率（RR）:60次/min，于左侧第五肋间开胸，暴露左肺，将气管导管过深插入至右侧支气管，调节通气参数VT：5-6ml/kg,RR：80次/分，见左侧肺叶萎陷，对侧肺通气，开始计时，至预定时间将气管导管退回主气管开始复张，恢复至双肺通气时的通气参数。B组则于暴露左肺后，始终保持双肺通气至预定时间。
标本采集 C组大鼠麻醉后迅速颈动脉放血处死，A组和B组通气至预定时间后立即颈动脉放血处死动物，分离两侧完整肺叶，置入预冷的生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，用滤纸吸干，分别取部分左肺下叶组织置入4％多聚甲醛固定48h，脱水后石蜡包埋，做肺组织切片。取余下左肺下叶组织，-80℃超低温冰箱保存待检。
检测项目与方法 HE染色光镜下观察肺组织形态结构的改变；免疫印迹法检测肺组织中Caspase-3蛋白的表达，Image Lab凝胶图像分析系统对胶片扫描后的Western blot反应蛋白条带图像进行分析，得出目标带的灰度值，计算出各组目标蛋白条带的灰度值和内参GAPDH蛋白条带的灰度值的比值；原位末端标记法(TUNEL)染色检测肺组织的细胞凋亡指数 (每张切片选取10个不重复视野，细胞核呈棕黄色染色为阳性细胞，计算每高倍视野中阳性细胞数和该高倍视野中细胞总数的比值)，计算平均值。
统计学分析 经SPSS13.0软件包进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x(_)±s)表示。各亚组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用 LSD-t检验。相对应亚组间样本比较采用t检验； P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
HE染色 C组肺组织无明显病理改变，肺泡结构形态完整，肺泡间隔正常；B组中B1组无明显病理改变，随通气时间增加B2，B3组肺泡内可见少量渗出液，肺间质增厚；A组中A1组可见少量渗出液，肺间质增厚；A2组、A3组非通气侧肺泡内可见大量红细胞，部分肺泡腔萎陷不张，肺间质增厚明显。
TUNEL染色 C组肺组织内未见明显凋亡细胞；B组在双肺通气2h肺组织内可见少量凋亡细胞。A组内各亚组随着通气时间的延长，A1组内未见明显凋亡细胞， A2组肺泡腔内侧面可见少量阳性细胞，其细胞凋亡指数较B2组明显增加（P＜0.05），A3组肺泡腔内侧面和肺间质的阳性细胞明显增多，其细胞凋亡指数与B3组比较明显增加（P＜0.05）
肺组织Caspase-3蛋白含量 与C组比较，A1组Caspase-3蛋白含量没有明显变化（P＞0.05），A2组和A3组表达增加（P＜0.05），且随着通气时间的延长，C组=A1组＜A2组＜A3组（P＜0.05）；与B组各亚组比较，A1组和B1组差异无统计学意义（P＞0.05），A2、A3组均较与之相对应的B2、B3组表达增加（P＜0.05）。
表1 各组大鼠肺组织细胞凋亡指数和Caspase-3蛋白表达的比较（n=6,`x±s）
检测指标
C组
A1组
A2组
A3组
B1组
B2组
B3组
AI(％)
0.12±0.08
0.13±0.08
6.17±0.75 ab
16.00±1.10 ab
0.15±0.10
0.18±0.08
4.83±0.75 a
Caspase-3
0.21±0.02
0.22±0.02
0.34±0.01ab
0.69±0.01ab
0.22±0.01
0.23±0.01
0.28±0.01a
与C组比较，aP＜0.05；与B组对应亚组肺相比较bP＜O.05；
讨 论
OLV作为一种特殊的机械通气现已广泛应用于胸外科手术中，但OLV期间由于非通气侧肺的血液没有得到充分的氧合而造成静脉血掺杂，从而引起肺组织缺氧，并导致肺组织细胞损伤以及功能的损害，此外，肺萎陷后复张及在复张通气过程中过度的牵张等都可引起一系列反应，可加重并且引起肺损伤[2]，甚至可引起VILI。实验结果发现，随着OLV时间的延长，大鼠肺组织逐渐表现出肺泡结构的破坏并出现充血水肿，肺间质逐渐增厚等变化,与前期研究结果一致[3]。
OLV引起肺部损伤涉及机械伤、生物伤等多种复杂的损伤机制。近年来的许多研究认为，各种因素通过诱导肺组织细胞的过度凋亡导致肺泡结构破坏，加重肺泡毛细血管膜的损伤而参与急性肺损伤的过程[4]。在机械通气的研究中，主要认为支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞由于机械牵拉的刺激，通过激活NF-κB的炎症级联反应，促进细胞的凋亡[1]。本实验中双肺通气对照组在通气2h时肺组织中可见有少量凋亡细胞；而在OLV组中，随着OLV时间的延长，在OLV1h复张0.5h时大鼠肺泡腔内侧面即可见少量凋亡细胞，OLV1.5h后复张0.5h时大鼠肺泡腔内侧面及肺间质中发现有较多凋亡的细胞，这些变化比在相同时间双肺通气组大鼠肺组织中表现更为明显。造成此种情况的原因可能与OLV经历了萎陷后复张通气复杂的病理生理过程相关，而这种复杂的过程可能比单纯的机械牵拉对肺组织细胞凋亡的影响更大。Krick及其同事[5]研究发现在低氧的状态下大鼠通过诱导低氧诱导因子 (HIF-1)可引起肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。在OLV过程中，非通气侧肺萎陷，肺泡氧分压下降，使得非通气测肺组织缺氧，可导致肺组织细胞的凋亡。而这种肺泡氧分压下降后可引起肺血管阻力增加即非通气侧肺缺氧性肺血管收缩(HPV)，是肺循环对缺氧的一种代偿反应，但是HPV在起到这些保护作用的同时，也减少了肺组织的血流灌注量。OLV时肺组织的低血流灌注及缺氧可激活肺组织中PMN, 激活的PMN耗氧量大增,不但进一步增加组织的缺氧,而且还释放大量的细胞因子和炎症介质。OLV组大鼠在OLV至预定时间后，均恢复通气0.5h,当恢复通气后，肺组织氧供的快速恢复也可激活肺组织中PMN并激活氧化应激反应，可使血液和肺组织中氧自由基、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-lβ（LI-lβ）等炎性介质增加[6]。游志坚等[7]的研究结果也表明兔OLV时肺组织氧化应激水平显著升高，并且随着OLV时间的延长，这种趋势表现的更为明显。然而大量的氧自由基、TNF-α和LI-lβ等炎性因子均可导致肺泡上皮细胞及血管内皮细胞凋亡的增加，并导致肺血管内皮屏功能的障碍 [8]。An S等[9]认为小肠缺血再灌注后通过上调TNF-α导致Ⅱ型上皮细胞凋亡从而引起肺组织损伤。在非通气侧肺萎陷后复张的过程中,肺泡的膨胀并非都是协调的,膨胀和萎陷肺泡交界处产生的界面切力对肺泡壁过度牵张可引起肺泡上皮细胞的凋亡[10]。本实验中随着OLV时间的延长肺组织凋亡细胞增多，可导致肺泡结构破坏和肺组织病理变化加重，这与本实验中光镜下观察到的肺组织病理改变相一致。
Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡效应因子，在凋亡的执行阶段，它负责对全部或部分关键性蛋白酶的裂解，从而使DNA片断化，导致细胞凋亡。因此大鼠肺组织Caspase-3蛋白表达的变化也可直接反应肺组织中细胞凋亡的情况。为了进一步了解OLV引起细胞凋亡的机制和作用途径，我们用免疫印迹法研究Caspase-3蛋白表达量的改变。从实验结果看，Caspase-3蛋白表达的变化和TUNEL检测的细胞凋亡变化的趋势大体一致，因而也证实了TUNEL法检测的结果。
综上所述，随着通气时间的延长，OLV可导致肺组织结构的改变，并导致细胞凋亡及其凋亡执行因子Caspase-3蛋白表达增加，由此推测细胞凋亡可能是OLV导致肺损伤的重要因素。但关于更具体的作用机理，还有待于进一步研究。
参 考 文 献
[1] 赵兵，张华茹，李海明等.大鼠机械通气相关性肺损伤与肺组织细胞凋亡的关系[J].中国实用医刊,2011,38(3):50-52.
[2] Plataki M, Hubmayr RD. The physical basis of ventilator-induced lung injury[J]. Expert Rev Respir Med,2010, 4(3): 373-385.
[3] 黎阳，彭丹晖，梁锐等.单肺通气过程血中性粒细胞计数和通气后肺组织形态学的改变[J].广西医科大学报,2009,26(5):733-734.
[4] Chopra M,Reuben JS,Sharma AC.Acute Lung Injury:Apoptosis and Signaling Mechanisms[J] .Experimental Biology and Medicine ,2009, 234:361-371.
[5] Krick S, Eul BG, Hanze J,et al.Role of hypoxia-inducible factor-1alpha in hypoxia-induced apoptosis of primary alveolar epithelial type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol 2005;32:395C403.
[6] den Hengst Willem A., Gielis Jan F., Lin Judy Y.,et al. Lung ischemia-reperfusion injury: a molecular and clinical view on a complex pathophysiological process[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,299(5):H1283-1299.
[7] 游志坚，徐红霞，周子超等. 不同时间单肺通气对肺部氧化应激水平的影响[J].中华全科医学,2010(12):1492-1493.
[8] Circu ML,Aw TY.Reactive oxygen species, cellular redox systems, and apoptosis[J].Free Radic Med,2010,48(6):749-762.
[9] An S,Hishikawa Y,Liu J,et al.Lung injury after ischemia-reperfusion of small intestine in rats involves apoptosis of type II alveolar epithelial cells mediated by TNF-alpha and activation of Bid pathway[J].Apoptosis,2007,12(11):1989-2001.
[10] Hammerschmidt S,Kuhn H,Grasenack T,et al.Apoptosis and necrosis induced by cyclic mechanical stretching in alveolar type II cells[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2004,30(3):396-402.
