恶性肿瘤的危害

目前恶性肿瘤严重威胁人类的健康和生命，是人类死亡的主要病因之一，其发病率逐年上升。肿瘤的治疗临床上是以手术或者放化疗为主，结合生物免疫以及中医药治疗为辅的综合治疗。其中化疗是绝大多数肿瘤病人都需要使用的重要治疗措施。少数肿瘤可以通过化疗达到临床治愈，然而对于大多数肿瘤化疗药物无法根本上铲除肿瘤。化疗失败的主要原因之一就是肿瘤耐药。肿瘤耐药可以分为原发耐药和获得性耐药，分别指肿瘤细胞在未接触化疗药时就已经具有的耐药性和在化疗过程中逐步产生的耐药性。肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物往往也产生交叉耐药，这种现象被成为肿瘤的多药耐药(multidrug resistance，MDR)，是放化疗失败和肿瘤复发的关键原因。

1、P-gp

人类P-gp 是1个磷酸化和糖基化的跨膜外向转运蛋白，由ABCB1(MDRI)基因编码, 位于人类染色体7q21.1, 由1280个氨基酸组成, 分子量为170000, 包含2个同源单体,每个单体又含有6个疏水跨膜部分和1个胞内ATP结合部位组成和高度保守的“Walker A”和“Walker B”结构。多种化疗药物包括蒽环类、长春碱类、紫杉烷类、鬼臼乙叉甙类及米托蒽醌、丝裂霉素等都是它的底物。肿瘤细胞上高表达的P-gp可以降低抗肿瘤药物在细胞内的累积，从而导致临床耐药的发生。

研究证实几乎所有类型的肿瘤，包括肉瘤、白血病、淋巴瘤等在内，均有MDR1基因的表达。根据MDR1基因在人体肿瘤中表达的水平，Nooter [6]将肿瘤分为三类：（1）MDR1基因高度表达的肿瘤，如肾癌、胰腺癌、肝细胞癌等。这类肿瘤的来源组织本身就有中等或高度的MDR1基因的表达，多表现为原发性耐药，化疗效果差；（2）MDR1基因中度表达的肿瘤，如乳腺癌、神经母细胞瘤、白血病等。这类肿瘤较敏感，但是大部分病人在化疗结束后都有复发，复发后MDR1基因表达的水平更高，对原来敏感的化疗药物耐药；（3）MDR1基因低度表达的肿瘤，如卵巢癌、小细胞肺癌等。虽然这类肿瘤对化疗药物敏感，但是也会产生多药耐药。Burger等[7]用实时定量RT-PCR方法分析了59例原发乳腺癌标本，结果表明P-gp的表达水平与化疗药物的初次治疗效果呈负相关，而且P-gp高表达的肿瘤往往预后较差。

P-gp已经成为一个重要的肿瘤靶点，通过抑制P-gp功能或表达从而逆转肿瘤细胞的多药耐药性，使肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性具有非常重要的临床研究和应用价值。P-gp抑制剂（MDR逆转剂、肿瘤化疗增敏剂）[8]近来成为研究的热点，根据P-gp抑制剂出现的先后顺序和作用特点将其分为三代：

第一代抑制剂的研究开始于1981年。有学者发现钙离子通道阻滞剂维拉帕米能够通过直接与部分抗肿瘤药物竞争P-gp药泵的外排作用，而提高肿瘤细胞内化疗药物的浓度，从而达到逆转MDR的作用。后来发现其他的钙通道阻滞剂也有类似作用。第一代P-gp抑制剂还包括：钙调蛋白拮抗剂，环孢菌素，喹啉及甾体激素类等，其中环抱素的作用最强。它们的主要特点是在体外试验中可以逆转甚至完全逆转MDR。但在体内试验中，由于自身的剂量限制性毒性，体内不能达到有效逆转MDR所需要的浓度，例如体内运用维拉帕米出现的严重心血管副作用和环孢菌素强烈的免疫抑制毒性等。第1代逆转剂在未达到抑制转运蛋白的低浓度就会出现严重的人体副作用, 从而失去临床应用价值。

第二代抑制剂是通过改造第一代抑制剂的结构，筛选出逆转活性高而自身毒副作用低的化合物，代表化合物有PSC833和VX-710（环抱素D的类似物）还有dexverapamil、dexniguldipine等。由于很多化疗药物既是P - gp 的底物，也是细胞色素P450的同工酶3A4的底物，增敏剂对P450 3A4的竞争结合影响化疗药物的代谢，导致化疗药物血药浓度升高，产生毒副作用。例如PSC833比环抱素逆转的作用强10~20倍，且在动物模型中与抗肿瘤药物联合应用时，可使肿瘤体积明显缩小，并有效延长荷瘤动物的寿命[9]。但在临床试验中发现，PSC833能够通过抑制细胞色素氧化酶P450-3A4介导的紫杉醇和长春新碱代谢，使患者血浆内细胞毒药物水平明显升高而产生毒副作用[10]。VX-710是一种能够同时抑制P-gp和MRP活性的逆转剂[11]，逆转活性很高，约为第一代抑制剂的100倍以上。然而, VX-710在与紫杉醇联合用药时能显著降低肿瘤患者的紫杉醇清除率导致毒副反应出现。

第三代P-gp抑制剂药物的特点是克服了第二代的缺陷，在与抗肿瘤药物合用时，不影响它们的药代动力学。主要包括：GF120918、LY335979、Lanquidar（R101933）、ONT2093（OC1442093）以及XR9576等。目前已进人临床试验的代表性化合物有LY335979和XR9576等。属于一种二苯基幽烷类衍生物，是一种P-gp高度特异性的抑制剂，但其并非P-gp的底物，对MRP及BCRP无影响，也是迄今发现的最强的P-gp逆转剂之一，XR9576是邻氨苯甲酸的新型衍生物，是一种逆转作用极强、P-gp高度选择性的抑制剂。体内实验表明, XR9576能够显著增强阿霉素、长春新碱及紫杉醇等对人体MDR肿瘤模型的治疗作用，而且不影响这些药物的药物代谢。Ⅱ期临床试验也证实其对部分多药耐药肿瘤有良好的逆转作用[12]。试验表明LY335979能够明显减小荷瘤小鼠的肿瘤体积，并提高实验动物的生存率，更为重要的是LY335979不影响细胞毒药物的代谢动力学，具有一定开发应用前景[13]。

2　MRP

MRP亚家族主要有9个成员:MRP1～MRP7、ABCC11和ABCC12，基本结构与P-gp类似，其中一个由5个α螺旋组成的N末端区域，而MRP4、MRP5则没有此结构。所有的MRP糖基化位点在第2部分的第1个跨膜域外部及末端的延长结构上。Colo等1992年从小细胞肺癌H69 /AR 耐药细胞系中克隆出耐药相关基因MRP属于MRPC家族。与P- gp不同，MRP主要转运疏水性不带电荷的分子或水溶性的阴离子化合物。许多已经证实能够逆转P - gp 介导的药物对由MRP介导的MDR无效。在肝癌细胞中研究发现[14]，MRP1 表达水平和肿瘤的分化、类型以及微血管侵入相关,MRP1 显著上调则肝癌预后明显较差。在对162 名手术切除肝癌患者的研究后，有学者发现MRP1-1666GG 基因型高表达与肝癌患者低存活率相关[15]。VOREM等[16]转染肝癌细胞株HepG2 反义cMOAT cDNA 使MRP2 基因的转录被抑制， 发现转染人细胞的NA 的浓度高低与MRP2 活性成反比，而相应的一些化疗药物的半数抑制浓度在cMOAT cDNA 组也降．证明对MRP2 基因的转录抑制后，可增强肝癌细胞的化疗敏感性，并逆转其多药耐药；目前，研究发现主要有以下药物可能逆转由MRP介导的MDR，包括维拉帕米及其衍生物、环孢素A、黄酮类、抗激素类、喹啉类。GST 酶抑制药、非甾体抗炎药如阿司匹林、吲哚美辛、异唑; 唑啉衍生物、地高辛等。维拉帕米可以通过竞争性的与膜上的耐药蛋白（P- gp、MRP1） 结合，达到逆转MRP 多药耐药，通过抑制耐药基因（P- gp、MRP1） 的表达增加化疗药物的敏感性[17]；Connor等在研究过度表达MRP1的NC IH460细胞时，又发现苏灵大( su-lindac)具有逆转MRP1介导的对ADR 的耐药[18 ]。以上药物能够进入细胞内抑制MRP，但是这些抑制剂与MRP亲和力低且缺乏特异性，可能是因为MRP主要转运阴离子化合物,而阴离子化合物如PAK -104P、非甾体抗炎药物和ONO1078 等很少进入细胞内,所以抑制剂在细胞内很难达到有效抑制浓度。

3　BCRP

BCRP是最近发现的一个ABC药物外排转运蛋白，其为分子量为95000的磷酸化蛋白，与其他的ABC转运蛋白相比较，在结构上属于半转运蛋白，仅有6个α螺旋和1个ATP结合位点，多在细胞膜上以同源二聚体的形式发挥作用。目前认为BCRP 定位于细胞膜, 这表明它可能主要参与膜内、膜外药物转运, 而不是改变药物在胞内的分布。BCRP在正常组织中的分布较广泛, 主要分布于具有分布、排泄功能的组织, 尤其在胎盘组织中含量特别丰富。

Fumitremorgin C( FTC)和GF120918是最早发现的BCRP 增敏剂，Rabindran[19]等发现了FTC可降低肿瘤细胞耐药性，增加细胞内的药物聚集，可以有效逆转米托蒽醌，阿霉素，topotecan耐药。而且对P -gp或MRP1介导的耐药性影响小，已经成为BCRP的药理学研究的有用工具，但因为神经毒性不能用于动物和人体。目前已经合成多种毒性低、活性强的FTC 类似物如Ko143，有望成为临床运用[ 20] 。Yasuo Imai等认为，植物性雌激素( phytoestro2gens)可以逆转BCBP介导的MDR，研究中发现，植物性雌激素/黄酮类化合物可增强SN - 38和米托蒽醌对BCRP转导的K562细胞的细胞毒性。糖基化的黄酮类化合物对P - gp 介导的长春新碱抗药性和MRP1 介导的VP - 16的抗药性均无影响，然而二者可以增加拓扑替康在K562 /BCRP细胞的积聚[ 21 ]。研究者认为，黄酮类化合物和糖基化黄酮类化合物可能会成为克服由BCRP介导的肿瘤细胞多药耐药的有效药物，如果将黄酮类化合物与BCRP底物的抗肿瘤药物联用，可能会改变药物动力学,从而提高特异抗肿瘤药物对肿瘤细胞的细胞毒性。Ahmed - Belkacem等[ 22 ]在研究中发现， 6 - Prenylchrysin和Tectochrysin是BCRP的特异抑制剂。与GF120918相比,这两种化合物对P- gp和MRP均无影响，表现出更低的细胞内毒性，且不改变ATP酶活性。Nakamura等[ 23 ]发现Gefitinib可以直接逆转BCRP介导的MDR。研究中,发现10μmol Gefitinib可以逆转肿瘤细胞对拓朴替康、SN - 38和米托蒽醌的抗药性，提高拓朴替康在耐药细胞内的蓄积。Gefitinib直接抑制拓朴替康转运到囊泡。双嘧哒莫[ 24 ]被发现是一种新的BCRP的底物，同时一些钙离子阻滞剂如尼卡地平、尼群地平和尼莫地平可有效抑制米托蒽醌在BCRP过度表达的HEK ( human embryo kidney,人胚胎肾)细胞的外排现象，而同为钙离子阻滞剂的地尔硫艹卓和维拉帕米无此效果。

近年来中药逆转肿瘤耐药的研究也得到了广泛的开展。对于中药的活性成分对药物代谢酶和转运体影响的研究很多，并且发现其中一些植物多酚、黄酮、萜类等对P-gp都有一定的抑制作用 [25-27]。有研究证实五味子醇甲A能够增强VCR对耐药肝癌细胞HepG2/ADR 的细胞毒作用，其机制是通过影响P-gp 底物复合物的形成及功能而实现逆转P-gp 介导的多药耐药［28］。

白花蛇舌草提取物对多药耐药白血病细胞HL260/ADR 的生长也具有极强的抑制作用，诱导MDR 其凋亡是其主要机制［29］。在K562/ADM 裸鼠移植瘤多药耐药模型中，张姚庆华等［30］发现复方藤梨根制剂可以增加肿瘤细胞内ADM蓄积浓度，实现部分逆转移植瘤的多药耐药性，其机制之一是通过抑制P-gp增加的而实现的。中药复方的研究也在同时进行，有研究发现由黄芪、白术、北沙参等组成的益气养阴方能显著提高顺铂对耐药细胞株A549/DDP 的增殖抑制作用，具有协同增效的作用，逆转A549/DDP 细胞的凋亡抵抗可能是其逆转MDR 的作用机制之一［31］。中药在逆转肿瘤耐药的同时，往往还具有抗肿瘤、调节免疫等功能，有利于提高肿瘤的整体治疗水平，这是一个颇具临床应用前景的新的研究领域。为临床抗肿瘤药物的研发以及抗肿瘤治疗新方法的发现带来了新的希望。