α-硫辛酸对高糖状态下内皮祖细胞的影响

动脉硬化及微血管病变基础上引发的心血管疾病(CVD)是糖尿病的主要并发症，是糖尿病致残致死的主要原因。血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)受损及功能失调，是导致糖尿病血管并发症发生与发展的始动因素。因此，研究内皮损伤的机制，寻找修复损伤血管内皮结构和功能的有效途径成为目前的研究热点。

内皮祖细胞(EPCs)是一种来源于骨髓、能在体外扩增并进一步分化为ECs而参与受损血管内皮的修复与血管新生，不管是动物实验还是临床研究均证实新生血管中25％的ECs是由EPCS分化而来的，所以，EPCs被认为是对各种心血管疾病和损伤血管进行治疗的重要生化因子。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)是保证EPCs迁移能力的重要物质。

在体内高糖环境下可引发氧化应激的出现，而氧化应激又可以导致EPCs功能受损及一氧化氮(NO)产生减少，而应用超氧化物歧化酶(SOD)干预EPCs后可使其分泌NO增加，功能恢复。抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等，非酶抗氧化系统, 包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽、褪黑素、α-硫辛酸(ALA)、类胡萝卜素、微量元素铜、锌、硒(Se)等。

本研究应用高浓度葡萄糖孵育EPCs，诱发氧化应激，测定培养上清的丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平，同时用实时荧光定量RTPCR观察GPx-1和eNOS的mRNA表达,用western blot测定GPx-1和eNOS的蛋白表达，然后应用抗氧化剂ALA进行干预，来探讨葡萄糖引发EPCs损伤的机制及治疗措施，为糖尿病血管并发症的预防及治疗提供依据。

1 、材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：清洁级健康雄性Wistar大鼠(体重180-200 g)15只，由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号：902035。

1.1.2 试剂 MDA及NO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，50％葡萄糖注射液(华瑞制药有限公司)，EGM-2MV培养基(美国LONZA公司)，大鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋有限公司);

人纤维连接蛋白(索莱宝科技有限公司)，胰酶(美国sigma公司)，RNA提取试剂Trizol Reagent(美国Invitrogen)，逆转录酶(M-MLV )、随机引物均为美国Promega生产，兔抗人多克隆GPx-1抗体(英国ABCAM公司)，兔抗人多克隆eNOS抗体(美国Santa公司)，ALA(日本卫才制药有限公司)。

1.1.3 实验仪器 紫外分光光度计(756MC)(上海精密仪器科学有限公司

)，ABI 7300 实时荧光定量 PCR 系统(美国PE公司)，UVP凝胶扫描系统(美国UVP 公司)，DYZ22A型双恒定时电泳仪及DYY-Ⅲ桥式电泳仪(北京市六一仪器厂)，倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)超净台(HFsafe1200)(力康发展有限公司)，二氧化碳培养箱(MCO-15AC)(德国Heraeus公司)，细胞培养板及培养瓶(美国Corning公司)

1.2 实验方法

1.2.1大鼠骨髓EPCs培养

用手术剪将处死大鼠的下肢取下，剪去下肢的皮肤，将下肢置于75％酒精浸泡30min，于超净台中沿膝关节将股骨与胫骨分开，剔除尽大鼠下肢的肌肉，无菌的条件下暴露下肢骨，浸泡在含有PBS的培养皿中，将大鼠下肢骨从两端截断，于超净台中用PBS反复冲洗骨髓腔;

然后将冲洗液缓慢叠加于大鼠淋巴细胞分离液上， 2000转/ min，离心20min，离心后管内液体分为三层，吸出中间白色云雾层，加入4倍体积的PBS混匀，1000转/ min，离心10min，弃去上清液后，再重复洗涤1次。末次离心后，弃上清，加入EGM-2MV重悬细胞。

Fn按照5ug/cm2，铺被到孔板里，将细胞悬液接种到六孔板及24孔板中，接种密度为2×106个/mL。48小时后首次全量换液，以后每天换液，7天后隔天换液。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况。

1.2.2EPCs的鉴定

形态学鉴定：每天在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。

EPCs摄取DIL-Ac-LDL，结合FITC-Lectin-UEA-1的实验：将培养第10天的细胞，加入含DIL-Ac-LDL(2.5ug/mL)培养基，孵育4h，用PBS洗涤3次，2％多聚甲醛固定20min，再加入FITC-Lectin-UEA-1(10ug/mL)，孵育1h，激光共聚焦显微镜下观察，双染为橙黄色的细胞为EPCs，计数双染细胞。

1.2.3实验分组

用0.25％胰酶/0.02％EDTA消化培养4天的EPCs，分组贴壁24 h后分别

给予葡萄糖5 mmol/L作为正常对照组(NC)、30 mmol/l葡萄糖作为高糖组(HS),葡萄糖(30 mmol/l) +α硫辛酸(40µg/l)作为ALA组，孵育EPCs 48小时，检测各项指标。

1.2.4 NO及MDA测定采用化学比色法，Western blot法测定EPCs GPx-1及eNOS表达，实时荧光定量RT-PCR法测EPCs GPx-1 mRNA的表达

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 13.0统计分析软件包进行分析。所有计量资料用均数±标准差( ±s)表示。多个样本均数比较采用完全随机设计单因素方差分析，以P0.05 为具有显著性差异。

2、结果

2.1 不同干预措施对EPCs分泌MDA的影响(Table 3)

高浓度葡萄糖干预48 h后培养上清MDA水平高于正常对照组(P0.05);应用ALA干预后与高糖组比较MDA水平下降(P0.05)。

2.2 不同干预措施对EPCs GPx-1及eNOS表达的影响(Fig1-4，Table 1)

高糖干预48小时后 EPCs GPx-1及eNOS表达显著低于对照组，而ALA干预后EPCs GPx-1及eNOS表达较高糖组显著增加(P均0.05)。

2.3 不同干预措施对EPCs GPx-1及eNOS mRNA表达的影响(Fig5-8，Table 2)

高糖干预48小时后 EPCs GPx-1及eNOS mRNA表达水平显著低于对照组，而ALA干预后EPCs GPx-1及eNOS mRNA表达较高糖组显著增加(P均0.05)。

2.4 不同干预措施对EPCs分泌NO水平的影响(Fig9，Table 3)

高糖干预48小时后 EPCs分泌NO水平低正常对照组(P0.05)，而ALA干预后EPCs eNOS表达较高糖组显著增加(P 0.05)，培养上清NO水平升高。

3、讨论

2004 年在美国糖尿病学会(American Diabetes Association, ADA) 年会上，Banting奖获得者Brownlee做了演讲：无论大血管还是微血管并发症都是同一发病机制,即高糖损伤的共同基础---氧化应激的;同年欧洲糖尿病研究学会( European Association for the Study of Diabetes, EASD) 年会最高奖获得者Ceriello发表演讲,认为氧化应激是胰岛素抵抗、糖尿病和心血管疾病的共同发生机制---共同土壤学说。

EPCs是在循环外周血中存在的一种能分化为血管内皮细胞(EC)的前体细胞，它来源于骨髓、脐血或胎肝。在血管损伤或组织缺血的情况下 , 存在于骨髓中的EPCs可以应答于局部释放的生长因子和细胞因子而增殖，分化为成熟的内皮细胞，并动员至外周血液循环，特异性的归巢于损伤或缺血部位，进一步增殖、分化为成熟的内皮细胞，参与血管新生和再内皮化。

一旦EPCs数量及功能受损，内皮损害和修复之间的平衡被打破，内皮层的完整性遭到破坏，由此发生动脉粥样病变。因此内皮祖细胞对于调节内皮细胞凋亡/再生平衡及保持内皮层的完整性有着重要作用。所以EPCs的功能与糖尿病血管并发症的发生和发展密切相关，是心血管疾病的预测因子。

Dernbach等[6]检测了健康成人EPCs的氧化敏感性，发现健康成人的EPCs细胞内ROS水平较低且氧化剂介导的凋亡较脐静脉内皮细胞低，而且EPCs表面的抗氧化剂如锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、GSH-Px和CAT的表达较脐静脉内皮细胞增加，说明健康人的EPCs较内皮细胞有更强的抗氧化能力;

从而促进了其生存能力，但这并不足以抵御危险因素对EPC内源性抗氧化系统的影响，在高水平氧化应激情况下，EPCs内的氧化还原状态失衡，导致细胞凋亡和衰老，从而损伤其功能。

血糖升高能通过PKC途径激活细胞内NADPH,生成大量活性氧族(ROS) ,损伤细胞,引起细胞正常生物活性下降,能量代谢、细胞信号转导及其他功能紊乱，也就是说，在高糖状态可以诱发氧化应激。还有研究表明，高糖可通过氧化应激和P38MAPK途径影响了EPCs的骨髓动员和存活率。

糖尿病患者和葡萄糖处理的EPCs造成NO的生物利用度降低或eNOS的辅基四氢生物蝶呤(BH4)下降，从而出现eNOS的解偶联，产生超氧负离子(O-)，导致活性氧簇(ROS)的积聚，进一步使EPCs的数量及迁移能力降低。被氧化LDL介导的细胞的氧化应激在动脉硬化的发病机制中其关键性作用。

OxLDL通过促进EPCs衰老的而影响其功能是通过对EPCs eNOS的抑制作用来实现的，最近的研究，糖尿病患者ox-LDL通过P53介导的信号途径导致EPC功能失调，相反HDL由于其具有抗氧化和抗炎症的特性而被认为是血管功能的保护因子。

本研究应用高糖孵育大鼠骨髓源EPCs 48h，结果表明，培养上清中MDA水平显著升高，说明高糖可导致EPCs产生氧化应激。Quagliaro 等的研究也提示,高浓度葡萄糖尤其是波动性高糖可通过二酰甘油及线粒体超氧阴离子的过度表达而活化蛋白激酶C(PKC) 通道,改变丝裂原活化蛋白激酶通路,促使细胞凋亡及DNA氧化损伤。

GPx-1是一个关键的氧化还原蛋白，它在保护内皮免受氧化应激的损伤从而保持血管环境稳定方面起着重要作用。研究表明，在离体颈动脉的斑块GPx-1活性下降。还有研究表明，GPx-1过表达能够使高浓度半胱氨酸培养的内皮细胞的血管内皮功能保持正常。

另外，还有研究表明缺乏GPx-1不仅会出现血管内皮功能失调，而且存在心脏和血管结构异常。另外，从GPx-1敲除小鼠分离的Ac-LDL+Lectin+ VEGFR-2+ eNOS+细胞无论体内还是体外都在促进血管发生方面存在功能缺陷并且存在对氧化应激敏感性增加[21]。C反应蛋白(CRP)干预EPCs后导致其糖基化终产物受体表达上调，使GPx-1及其它抗氧化酶表达下调，同时导致EPCs在体内的衰老和功能紊乱，进一步导致细胞凋亡增加。

eNOS是细胞色素P450 还原酶样酶, 可催化黄素介导的从电子供体NADPH到亚铁血红素辅基的电子转移。eNOS的辅基BH4 靠近亚铁血红素基, 可将电子传递到L精氨酸的胍基氮上从而产生NO。缺少L精氨酸或BH4时, eNOS会产生O2- 和H2O2 , 这个现象被称为eNOS解偶联。

eNOS在EPCs的动员与功能调控中发挥着至关重要的作用，eNOS解偶联引起ROS水平升高从而造成EPCs功能受损。在糖尿病患者，eNOS解偶联减少了糖尿病患者的EPC数量，降低了其功能，最终导致了血管疾病的发生。

有研究表明，eNOS是保证EPCs迁移能力的重要物质，eNOS基因敲除小鼠可导致EPCs迁移能力下降[25]，而保证eNOS的充分表达，保证NO的正常分泌及正常的生物活性是维持EPCs正常生物学功能的重要因素，本研究应用高浓度葡萄糖干预EPCs48h，发现EPCs的GPx-1蛋白表达及mRNA表达水平下降，同时存在eNOS蛋白表达mRNA表达及下调，NO分泌减少;

所以，本研究结果说明高糖除了可以使EPCs产生氧化应激之外还可以下调其抗氧化酶的表达，从而损伤其抗氧化能力，影响其功能。

ALA是一种天然抗氧化剂，它可以清除机体生理和病理过程中产生的各种自由基，减轻机体氧化应激。研究表明，ALA可以通过增加NO的活性，减少ROS的产生[26]，抑制NF-κB的表达,而改善大鼠血管内皮功能，还可以通过激活内皮细胞AMPK途径，逆转高糖诱导的线粒体膜超极化作用，降低体内氧化应激水平。

本研究通过对高糖孵育的EPCs应用ALA进行干预，结果发现，EPCs的GPx-1及eNOS表达均上调，EPCs分泌NO增加，分泌MDA减少，说明ALA治疗可以减轻高糖诱导的EPCs产生氧化应激，恢复其抗氧化能力，从而保护其功能。

总之，高浓度葡萄糖一方面可以诱发EPCs产生氧化应激，另一方面减少其抗氧化酶的生成与表达，损伤其抗氧化能力，而抗氧化应激治疗可以改善EPCs的抗氧化能力及分泌NO能力。这提示我们，抗氧化应激治疗对预防和治疗糖尿病血管并发症的发生、发展具有一定意义。