脐血移植基础和临床研究进展

对于同胞间HLA相合供者的不足，近十余年来已将供者扩展到HLA相合的无血缘关系人群。由于无血缘关系骨髓移植HLA相合程度要求很高，虽然国家花费巨大的人力和物力建立了造血干细胞资料库，仍然只有部分人群能受益于无关供者骨髓移植。1988年Gluckman E报道首例脐血移植（UCBT）成功，证明了脐血移植临床应用的潜能以来，国外很多国家建立了公共脐血库以解决供者来源的不足，同时广泛开展了脐血造血干细胞移植临床研究工作并取得了长足的进展。到2006年为止，估计全世界库存脐血约250，000份并已有近万例儿童和成人患者接受了同胞或无关UCBT。国内自90年代初先后在北京、广州、济南、天津、上海等城市建立了规模的脐血库，目前库存脐血总量约4万份，估计全国开展UCBT超过300例，主要为无血缘关系UCBT。以往多数临床研究表明，4-6位点相合的脐血能重建儿童血液肿瘤患者的造血和免疫系统，取得较好的治疗效果。然而，脐血移植在成人中的应用由于其很高的移植相关死亡率而受到限制。近年的临床资料表明，在大体重儿童和成人以及非恶性疾病中均取得了非常好的效果，且脐血移植的数量在逐年增加。虽然脐血移植在临床上取得了较大的进展，但由于脐血细胞数量少和其免疫的不成熟，UCBT植入率低和造血恢复延迟以及免疫重建缓慢而增加患者感染和早期移植相关死亡为其突出问题。

在儿童和成人allo-HSCT中的地位

在儿童allo-HSCT中的地位已确立，无论是同胞还是无血缘UCBT临床疗效均与相应的同胞和无血缘BMT疗效相当。前者的结论来之于Rocha等对同胞UCBT和BMT的比较研究，他们分析113例HLA相合儿童UCBT和2052例HLA相合儿童BMT的临床结果。重点比较了两组移植方式的急、慢性GVHD发生率、植入率和生存情况。发现UCBT组未能植活的比例要高于BMT组， GVHD发生率在UCBT患者无论是急性GVHD还是慢性GVHD均低于BMT组，3年生存率分别为64％和66％，无显着统计学差异。

对于儿童无血缘UCBT，Rocha等

回顾性地分析了541例儿童急性白血病患者应用无血缘UCBT和无血缘BMT的多中心研究结果。单因素分析表明，UCBT患者中性粒细胞和血小板恢复较BMT患者延迟；大于II度急性GVHD和慢性GVHD的发生率在UCBT和T细胞去除BMT患者较BMT患者明显降低；而UCBT患者早期TRM较高。100天后复发率、死亡率在3组病例相当。2年复发率、总生存率及无病生存率（DFS）在3组病例无明显的差异。为了进一步阐明UCBT的优缺点，Barker等。应用前展性、随机方法进行配对研究了儿童HLA 0－3位点不合的无血缘UCBT和HLA完全相合的无血缘BMT患者中性粒细胞和血小板恢复、GVHD发生和生存情况。结果表明UCBT患者中性粒细胞恢复延迟，而血小板恢复时间两组相似，中性粒细胞植入率在UCBT组和BMT组亦无显着差异。尽管UCBT组脐血与受者HLA差异较大，但与BMT相比并没有加重GVHD的产生，早期死亡率亦无明显差别，且2年的生存率亦无明显差异，分别为53％和41％。这项研究说明尽管UCBT组HLA差别较大，但与配型相合的BMT相比，无论在植入率、GVHD和生存率方面均无显着差异，表明脐血完全可以替代无血缘关系骨髓进行儿童造血干细胞移植。

影响UCBT在成人广泛应用的主要原因是脐血中有核细胞数量少而增加移植失败的风险和造血延迟恢复，因为脐血中有核细胞的数量只为骨髓移植物的1/10。因此，早期脐血移植只是作为高危血液系统肿瘤治疗的最后选择。最近来自欧洲和北美的两个多中心大宗病例报告详细分析了成人急性白血病无血缘BMT和无血缘UCBT的临床研究结果。欧洲资料[6]比较了1998-2002年682例成人急性白血病无血缘关系造血干细胞移植的临床结果，其中UCBT组 98例，BMT组 584例。多变量分析显示UCBT发生急性GVHD的风险较低， 但中性粒细胞恢复明显延迟。两组慢性GVHD发生率、TRM、DFS均无显着性差异。因此该研究作者提出，对于成人白血病患者，若无HLA匹配的骨髓供者，UCBT是一种可以接受的治疗手段。北美资料比较了国际骨髓移植登记组（IBMTR）的600例成人白血病进行无血缘HSCT的临床结果，该研究得出与欧洲类似结论。

脐血细胞数量和HLA相合程度对脐血移植效果的影响

限制脐血移植临床应用的主要因素是其有核细胞数量。多数研究证明低脐血细胞数量与低植入率、高TRM和低生存率有关，尤其在大体重儿童和成人脐血移植患者。例如，Wagner 等。报道如果输入CD34+细胞数少于1.7 x 105/kg,则TRM超过70％。2006年欧洲脐血移植协作组（Eurocord）推荐脐血细胞数量应高于3 x 107/kg[2]。

除脐血细胞数量之外，HLA相合程度也明显影响脐血植入和患者生存。Eurocord 报道随着HLA不相合程度的增加，其移植相关死亡率增加。纽约血液中心（NYBC）分析大宗脐血移植病例，其HLA 6/6~3/6位点相合，发现HLA不合程度与移植效果关系密切[9]。然而纽约血液中心（NYBC）报道在HLA 6/6位点相合的脐血移植病例，移植效果与所输有核细胞数量（0.7-10 x 107/kg）无明显相关性。作者认为，这可能是HLA相合补偿了脐血数量的不足。因此对于脐血的筛选，既要考虑脐血细胞的数量又要考虑HLA配型的相合程度。HLA配型不合程度越大，所需细胞数量就越多。因此Eurocord建议当HLA分别为 6/6、5/6、4/6相合时，TNC应分别大于3 x 107/kg、4 x 107/kg 和5 x 107/kg,这样可获得“满意”的单份脐血。对于这种脐血选择的建议，仍然需要前瞻性的研究来证实。

解决脐血植入失败和造血重建延迟的策略

如上所述，影响脐血植入的主要因素除与细胞数量有关外，供受者HLA相合程度对植入亦有重要影响。虽然脐血允许HLA 1－2个位点不合，但HLA高匹配程度可能改善脐血干细胞的植入率。因此要改善脐血干细胞植入，最重要的是选择HLA尽可能相合的脐血、增加脐血干细胞的数量和促进造血细胞增殖和分化。

选择有核细胞数及CD34+细胞数较高的脐血：在众多的影响因素中，脐血有核细胞和CD34+细胞数量是移植成功的关键。在考虑HLA相合程度后，Wagner 等。建议HLA 0－2位点不合的多份脐血可供选择时，应首先考虑有核细胞或CD34＋细胞的数量。

.体内促进造血细胞成熟：除HSC数量外，脐血干细胞本身“不成熟”的特点也可能是其植入延迟的原因之一。已证明脐血较骨髓造血干细胞分化为巨核细胞的时间明显延长，早期应用细胞因子IL-11可加速造血重建。早期（0-7天）应用G-CSF可明显加速中性粒细胞造血恢复，并可能提高生存率。我们在脐血移植+1天开始应用重组人IL-11可明显加快血小板恢复，血小板20 x 109/L的时间由一般报道的40-60天缩短为平均约25天。另外由于造血干细胞分化成熟受其他细胞的调节，可否通过体内或体外应用非造血细胞或免疫细胞促进脐血干细胞成熟而加快造血重建有待研究，这些包括成熟血细胞、淋巴细胞、抗原呈递细胞和间充质干细胞等。

脐血干细胞扩增：通过体外扩增脐血HSC，提高输注的HSC量，将有望缩短造血重建的时间，但到目前为止有效的扩增体系尚未建立。较有前景的也许是Hox基因产物，其中HoxB4最为引人注目。通过逆转录病毒感染使HSC过表达HoxB4 mRNA，脐血HSC能扩增100倍以上，如果用TAT-HoxB4（一种可溶性HoxB4蛋白）处理纯化的HSC，也能使HSC扩增100倍。体外与间充质干细胞滋养层共培养也能增加造血干细胞的扩增效果。

双份脐血同时移植：为提高脐血移植的细胞数，I期临床试验尝试了同时输注两份HLA部分相合的脐血移植。明尼苏达大学Barker等。报告了23例高危组恶性血液病患者接受2份UCBT的临床研究结果。患者中位年龄24岁（13岁C53岁），采用清髓性预处理方案，两份脐血总有核细胞中位数为3.5 x 107/kg。可评价患者21例，脐血植入时间23天，II°CIV°、III°CIV° aGVHD发生率分别为65％和13％；1年DFS为57％，其中缓解期移植者1年DFS为72％。我们的研究也证明双份脐血移植是安全的，可以克服成人患者因单份脐血细胞数不足而无法进行脐血移植的问题。

加入低剂量半相合CD34+细胞：Fernandez 等[17]研究表明脐血联合低剂量单倍体CD34+细胞可加速脐血植入速度，中性粒细胞恢复快，感染发生率明显低。早期以单倍体细胞植入为主，后逐渐被脐血取代，100天内90％的患者转变为完全脐血嵌合体。4年DFS高达65-82％。

.骨髓腔内脐血注射：动物实验和临床研究证明，脐血直接骨髓腔内注射可增加植入率和缩短植入时间，从而提高脐血移植的生存率。Ibatici A 等[18]应用脐血骨髓腔内直接植入的方法进行了29例成人脐血移植，中位年龄38岁，HLA配型18例4/6、10例5/6、1例3/6位点相合，中位有核细胞数量为2.3（1.4-4.2）x 107/kg。多数患者采用经典CY/TBI预处理方案。所有生存超过14天的患者达到100％脐血植入，中性粒细胞和血小板植入的中位时间分别为+23和+38天，较常规脐血移植植入时间明显缩短。只有8％发生I-II度急性GVHD。由于随访时间短，尚不能评价其生存优势。

.减低预处理强度：减低预处理强度或非清髓已用于高龄、长期化疗和合并重要器官功能受损的患者。Brunstein 等[19]应用环磷酰胺/氟达拉宾预/200cGY预处理措施进行110例脐血移植（多为双份）治疗成人进展期恶性血液系统疾病，其3年生存率可达到45％。Ballen 等[20]应用氟达拉宾/马法兰/ATG预处理方案进行21例双份成人脐血移植，100天移植相关死亡率仅14％，1年无病生存率高达67％。这些研究结果表明对于不适合清髓预处理的患者，非清髓预处理后进行脐血移植也可取得较好的治疗效果。

加快脐血免疫重建的策略

无论何种干细胞来源，HSCT后都必须重建供者来源的免疫系统。由于脐血免疫重建相对缓慢，感染发生率高，早期移植相关死亡率高。因此除移植后加快造血重建促进中性粒细胞恢复以减少细菌和真菌感染外，加快UCBT后细胞免疫重建亦是减少感染提高患者生存率的关键。HSCT后早期免疫重建阶段T细胞主要来自供者胸腺后T细胞，这些细胞已经成熟，具有抗原特异性和功能特异性。但成熟T细胞的过继免疫并不是静止的，它们可以通过与宿主微环境相作用而受到调节（如胸腺或胸腺外细胞因子IL－2，IL－7，IL－15等）。HSCT后持久的T细胞免疫重建依赖于造血干细胞从头发育而来，发育过程与胎儿T细胞的发育相同，所需时间也类似。胸腺微环境对T细胞的这一发育过程至关重要。化疗、放疗、GVHD、受者年龄增大等均能损伤胸腺微环境，影响HSCT后免疫重建。

由于UCBT免疫重建相关的HSC在数量上明显减少和在质量上发育不成熟，从而导致免疫重建延迟或削弱。脐血中胸腺后T淋巴细胞几乎全是na?ve T，而na?ve T细胞很难活化，造成UCBT后T细胞对特殊抗原的应答能力比成人移植物的记忆T细胞弱。除T细胞外，脐血中抗原呈递细胞（APC）也与成人不同。UCBT的这些免疫重建特征不仅意味着对HLA不相容的耐受性更强，也意味着UCBT受者对病原体的应答能力减弱，感染发生率增高，感染死亡的危险性大。但这并不意味着移植物抗白血病（GVL）效应的减弱，恰恰相反，UCBT后白血病的复发率很低，可能与脐血细胞介导的较强的GVL效应有关。

近年基础研究和临床实践提出了加速脐血移植后免疫重建的策略，其措施包括：1）加速胸腺前T细胞发育，可通过增加HSC或淋巴前体细胞（CLP）数量。小鼠接受致死量照射后联合移植CLP及HSC比单用HSC能显着降低CMV的感染率，与移植大量胸腺细胞相比，少量CLP就可显着提高小鼠抵抗CMV的能力。这一技术的难点在于获得足量的CLP，可能的解决方案是激活Notch通路，使HSC扩增并产生更多的CLP。2）改善胸腺功能，补充胸腺分泌的细胞因子如IL－7。小鼠模型中给予IL-7能显着提高移植后胸腺细胞的生成，但IL-7同时可促进成熟T细胞扩增，有增加GVHD的风险。3）应用胸腺保护剂角化细胞生长因子（KGF）。KGF是来源于间充质细胞的纤维母细胞生长因子家族成员，与上皮特异性受体结合。在实验模型和临床试验中给予KGF可减少预处理毒性，使用后胸腺细胞产量增加，淋巴细胞恢复加速，GVHD发生减少。4）减少预处理毒性以减轻胸腺微环境损伤。Duke大学比较了非清髓和清髓UCBT的免疫重建情况，发现非清髓UCBT髓系和淋系恢复更快、更稳定。可能是由于非清髓方案损伤较轻或非清髓方案GVHD发生率低，从而更好的保护了T细胞增殖发育所需的外周和胸腺环境。5）尽量减少移植物中T淋巴细胞损失：移植物中的T细胞有促植入作用，它可以加速HSC分化形成胸腺前T细胞的能力，这些细胞在胸腺微环境的作用下进而产生有免疫功能的T细胞。虽然脐血中T细胞多为naive T细胞，但在移植早期的免疫重建中亦发挥重要作用。因此减少移植物中T细胞的损失对加快UCBT后的造血和免疫重建具有积极意义。因此预处理应用抗胸腺细胞球蛋白一方面可促进脐血干细胞植入，但去除了脐血中的T细胞对免疫重建有负面影响，可使免疫恢复延长数月[26]。

造血干细胞移植的临床选择

近十余年UCBT的发展充分证明，该治疗方法已成为无血缘BMT的一种有效替代方法，显示出了巨大的应用潜力，成为造血干细胞移植领域的重大进展之一。通过大宗病例分析，已确立UCBT在儿童和成人异基因造血干细胞移植的地位。因此建议临床需要进行造血干细胞移植的患者如果在需要的时间内找不到合适的无血缘关系供者，可采用HLA 1-2位点不合的UCBT。由于双份脐血移植可明显提高临床效果，脐血移植的适应症还可以放宽。因此Sanz MA 建议对于无合适亲属供者的患者，应同时查询脐血库和骨髓库，以便能及时找到合适的供者，这样可弥补无血缘供者查询时间过长而延误患者的治疗时机。近年由于国内造血干细胞资料库容量的扩大和较成熟开展了HLA配型不合的亲属间造血干细胞移植，已使较多患者能找到较合适的供者，但UCBT仍有较大的应用空间。由于脐血查询方便和易于获得的独特优点，对于病情不稳定而急需进行移植的患者是最好的选择。今后应着重改进治疗策略，使脐血能迅速且持久植入，并研究加速UCBT免疫重建的措施，降低移植相关死亡率，这样可使UCBT的临床效果会有较大的提升空间。相信在未来5-10年的时间里UCBT的临床应用会更加广泛。