二妙散不同配伍对大鼠佐剂性关节炎

类风湿关节炎是临床常见病。笔者认为RA活动期中医病机主要是湿热毒邪痹阻关节，临床上应用二妙散治疗效果显著。本文利用AA动物模型，观察二妙散不同配伍的抗炎效应，为其临床应用以及作用机制提供动物实验依据。

1、材料与方法

1.1动物及分组 雌性8周龄W istar大鼠90只, 购自山东中医药大学实验动物中心，体重(150±20)g，SPF级，动物许可证号码：SCXK(鲁)20111118。按随机数字表法分为9组(每组10只)，分别为空白组、模型组、对照组、苍术1黄柏1、苍术1黄柏2、苍术2黄柏1、苍术组、黄柏组、黄柏苍术单煎合并组，均给予等量蒸馏水，正常饲料喂养。

1.2药物与试剂 二妙散组成为苍术、黄柏。由我院制剂室统一配备，分别调配成生药浓度为0.64g/mL、0.43g/mL、0.43g/mL、0.32g/mL、0.32g/mL、0.64g/mL的药液。雷公藤多苷片：黄石飞云制药有限公司生产，剂量规格为10mg/片。实验试剂有完全弗氏佐剂、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)和α肿瘤坏死因子(TNF-α)。

2、造模与给药

除空白组外，各组大鼠均于右后足趾皮下注射完全弗氏佐剂0.1ml，造模成功的标准是大鼠右后足趾皮纹消失。

造模成功后，空白组不用药，其他各组大鼠均于造模后第1天给药，剂量统一规范为2.5mL。详细如下：模型组每天每只灌服生理盐水2.5ml;对照组每天每只灌服雷公藤多苷片4mg/2.5mL;苍术1黄柏1组每天每只灌服中药液1.6g/2.5mL;苍术1黄柏2组和苍术2黄柏1组每天每只灌服中药液1.2g/2.5mL;苍术组、黄柏组每天每只灌服中药液0.8g/2.5mL;单煎合并组每天每只灌服中药液1.6g/2.5mL，药液为苍术、黄柏单煎后合并，二者比例为1:1。每天灌服的剂量按照生药浓度计算所得。

除空白组外，其他大鼠均每日灌胃用药至实验结束前一天，共22天。

3、实验检测项目

(1)测关节肿胀度 造模当天、造模后每3天用游标卡尺测量大鼠右下肢足跖中后1/3处厚度，每只大鼠测量2遍，取均值作为肿胀数值并做记录。

(2)检验血清标本 给药阶段结束后，以2％戊巴比妥钠以腹腔注射方式麻醉动物，剖腹抽取下腔静脉血，离心后取血清，取IL-1、IL-4、IL-6、TNF-α试剂盒，分别加样化验检测。

(3)关节病理送检 每组取2只大鼠，对右膝关节囊进行常规病理切片送检。

4、实验结果

(1)各组大鼠的足跖肿胀度

造模当天各组大鼠右后足跖注射部位均出现明显肿胀。之后在4-7天内，所有造模大鼠的注射部位肿胀程度相继达到高峰。一周左右时，多数大鼠开始出现左膝关节处肿胀。至两周时，左膝关节肿胀逐渐倾向稳定。之后随着灌药天数的增加，部分大鼠的左膝肿胀程度出现不同程度的缓解，极少数大鼠在切取标本前左膝关节肿胀消失。肿胀详细数值及用药后的测量见表1。

表1 对右后足跖肿胀影响(mm)

组别

天数

空白组

模型组

对照组

苍术1

黄柏1

苍术1

黄柏2

苍术2

黄柏1

苍术组

黄柏组

单煎合并组

0

3.93±0.27

4.09±0.40

3.85±0.46

4.07±0.58

4.29±0.31

4.43±0.32

4.32±0.16

4.08±0.49

4.36±0.59

1

3.96±0.30

7.38±0..40

7.45±0.46

7.26±0.39

7.29±0.52

7.62±0.47

7.60±0.55

7.57±0.27

7.35±0.15

4

4.02±0.46

7.99±0.65

8.22±0.54

8.02±0.57○

7.96±0.59○

8.15±0.67○

7.88±0.45○

7.74±0.52○

7.92±0.32○

7

3.94±0.33

7.90±0.39

8.31±0.24

7.95±0.55○

8.05±0.49○

8.21±0.67○

7.92±0.60○

7.83±0.48○

7.98±0.45○

10

3.92±0.40

7.87±0.40

8.26±0.30

7.68±0.45○

7.98±0.40○

8.12±0.56○

7..88±0.56○

7.75±0.48○

7.87±0.43○

13

3.95±0.41

7..78±0.42

8.12±0.33

7.49±0.42○

7.76±0.41○

7.98±0.45○

7.72±0.48○

7.62±0.34○

7.62±0.38○

16

3.93±0.35

7.69±0.38

7.98±0.42

7.26±0.35○

7.59±0.39○

7.82±0.40○

7.60±0.36○

7.58±0.43○

7.52±0.33○

19

3.95±0.40

7.60±0.41

7.82±0.35

7.02±0.45○

7.45±0.36○

7.69±0.30○

7.50±0.46○

7.49±0.37○

7.29±0.45○

22

3.94±0.35

7.56±0.42

7.70±0.42

6.80±0.36○

7.36±0.42○

7.59±0.46○

7.41±0.35○

7.38±0.42○

7.12±0.38○

注：经t检验分析，所有用药组与模型组比较，P0.05，中药组与对照组比较，○P0.05。

通过表1可以看出，用药后，各组大鼠的足跖肿胀均在第2周前后时间出现逐渐缓解，提示中西药物对大鼠足跖的炎症均有抑制作用，各用药组与模型组比较均有统计学意义(P0.05)。同时，二妙散的不同配伍组、单味药组与对照组比较均有统计学意义(p0.05)。中药等量配伍组与其他各组之间也有统计学意义(p0.05)。可见从缓解关节肿胀的程度而言，苍术1黄柏1组治疗效果最佳。 span=

(2)药物对炎性细胞因子的影响

中、西药物对大鼠血清炎性细胞因子的影响结果，详见表2。

表2 药物对血清炎性细胞因子的影响

细胞因子

组别

IL-1β

IL-4

IL-6

TNF-α

空白组

54.01±13.19

307.04±12.48

59.64±8.39

1.19±0.25

模型组

112.55±10.54

41.36±4.15

68.31±6.72

1.95±0.05

对照组

85.90±13.89○

115.64±12.18

62.03±5.44

1.75±0.09

苍术1黄柏1

69.29±10.90○

170.40±10.76○

38.69±8.97□

1.23±0.12○

苍术1黄柏2

79.39±1229○

139.09±10.61○

49.60±5.02□

1.42±0.25○

苍术2黄柏1

76.64±15.89○

140.26±9.18○

45.88±8.43□

1.47±0.05○

苍术组

87.56±9.32

123.66±15.23

46.26±9.33□

1.60±0.38

黄柏组

90.78±13.56

130.55±13.56

51.69±5.43

1.58±0.24

单煎合并组

86.34±12.75

125.36±15.33

56.59±4.29

1.56±0.08

注：经t检验分析，所有用药组与模型组比较，P0.01;中药组与对照组比较，○P0.05，□P0.01。 span=

通过表2可以看出，能够反映炎症严重程度的IL-1β、IL-6、TNF-α以模型组最高，反映抑制炎症的细胞因子IL-4以模型组最低，与空白组比较均有统计学意义(P0.01)。二妙散的不同配伍剂量组与模型组大鼠对血清细胞因子的影响比较有统计学意义(p0.01)，与对照组比较也有统计学意义(p0.01)，其中il-1、il-4、tnf-α(p0.05)，il-6(p0.01)，充分说明了二妙散不同配伍的疗效均较对照组为佳。而 span=苍术1黄柏1组与其他各用药组比较均有统计学意义(P0.05)，说明二妙散原方1:1的比例疗效最佳。 span=

(3)药物对关节病理切片的影响

空白组：所切取的关节腔内偶有较少量的纤维结缔组织，偶见慢性炎症细胞，关节囊内无充血、无水肿。

模型组：所切取的关节腔内可见纤维组织明显增殖，并可见到大量的慢性炎症细胞的浸润，伴见明显的肉芽组织，有典型的淋巴滤泡形成，关节囊内充血和水肿均很明显。(见图1所示)

各用药组：所切取的关节腔内病理较模型组均有明显改变。纤维组织增生较模型组程度为轻，慢性炎症细胞可见数量明显减少，充血和水肿程度也较模型组明显缓解。二妙散不同配伍组较对照组、中药单煎组、单体混合组改善明显。说明二妙散配伍各组的抗炎疗效较好，尤其以原方1:1的比例疗效最佳。(见图2、3、4所示)

其结果见：光镜下病理切片(如图1、2、3、4)。

图1 (模型组×100) 图2 (对照组×100)

图3 (苍术1黄柏1组×100) 图4 (苍术组×100)

5、讨论

RA属中医学“热痹”、“侗浴狈冻搿1静』疃诨静』喔谠淌榷荆庖苑纭⒑⑹刃按踊钪盏贾率榷拘氨宰杈纭⒔盥觥⒐墙冢任饕±硪蛩[1]。

现代医学发现，IL-1与TNF-α是RA发病过程中起重要作用的细胞因子，除了可以导致滑膜炎症外，还可以导致关节的进行性破坏[2]。有研究表明IL-1、TNFα的降低与临床活动性(临床指标及实验室指标)的改善密切相关[3]。IL-4的抑炎作用主要体现在其调节RA多种不同类型细胞的活性，从而抑制TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等的活性，抑制NO的合成、PGE2的产生，从而控制炎症发生，保护关节软骨和关节下骨及其他关节组织的完整性。越来越多的看法认为在细胞与分子水平上抑制致炎因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等的活性，上调抑炎因子IL-4、IL-10的活性，或许可为治疗RA的战略提供新的线索。

中医的不传之秘在于剂量，不同比例的配伍发挥的作用可能差别很大，本研究发现二妙散不同配伍的作用大小不同，苍术与黄柏配伍比例1:1时无论对大鼠致炎足趾的消肿效果还是对血清炎性细胞因子的影响效果都是最明显的，由此可见二妙散中苍术黄柏等量配伍意义重大。