免疫组化技术

一、ABC 法（SP、LSAB、SABC法步骤相同）

ABC(avidin-biotin comeplex)卵白素-生物素复合物法属于亲和免疫组织化学技术，根据卵白素-生物素高亲和力的生物学特性，用生物素与过氧化物酶结合获得生物素过氧化物酶，再加入卵白素和生物素形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物。而LSAB、S-P、SABC是以抗生物素蛋白链酶素代替卵白素，用标记了过氧化物酶的抗生物素蛋白链酶素（SA）代替ABC复合物，步骤相同，但由于SA分子量较小，穿透性较好，反应速度较快。并且SA有两个和生物素亲和力极高的结合点，其本身没有连接生物素，可以与二抗上的生物素连结，比ABC更容易与二抗上的生物素结合，故敏感性高，复合物也不需要使用前混合，更为简单方便。ABC为三步法，第二抗体为生物素化的IgG（或IgM、IgA等），其中的Fab片段与第一抗体结合，这就要求与第一抗体相配对，如第一抗体是鼠抗，第二抗体应该为抗鼠的（或IgM、IgA等）；如第二抗体是兔抗，第二抗体应该为抗兔的（或IgM、IgA等），还有羊、大鼠、马等来源的抗体。如果使用了鼠兔通用型二抗，那当一抗是鼠或兔时就不必再分了。由于卵白素和生物素亲和力强，故ABC较PAP敏感20-40倍。最后通过复合物上的过氧化物酶与显色反应形成有颜色的沉淀物，可用显微镜观察。过氧化物酶最好的显色剂为DAB，形成不溶于水的棕色颗粒，可用酒精脱水、二甲苯透明；如用AEC显色，生成溶于水的红色沉淀，故不能脱水，只能用水溶性封片剂封固，不利于长期保存。

步骤：

1、切片脱蜡至水

2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30％ H2O2)室

温20分钟。水洗。

3、抗原修复：（1）pH7.2 TBS 缓冲液洗三次，胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟。或（2）按说明书要求：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟，快速冷却；或(3) 按说明书要求：不处理）

4、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

5、滴加正常血清37 ℃，30分钟。

6、甩去多余血清，加一抗37 ℃，30分钟。，

7、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

8、滴加二抗，37 ℃，30分钟。

9、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

10、滴加ABC复合物，37 ℃，45分钟。

11、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

12、DAB显色3～10分钟。

13、水洗。

14、苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固。

二、PAP法

步骤：

1、切片脱蜡至水

2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30％ H2O2)室

温20分钟。水洗。

3、抗原修复：（1）pH7.2 TBS 缓冲液洗三次，胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟。或（2）按说明书要求：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟，快速冷却；或(3) 按说明书要求：不处理）

4、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

5、滴加正常血清37 ℃，30分钟。

6、甩去多余血清，滴加特异性抗体37℃30―60分钟或4℃过夜，置湿盒中。

7、PBS洗。

8、滴加二抗，37 ℃，30分钟。

9、 pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

10、加PAP抗体37℃ 30分钟。

11、pH7.2 TBS缓冲液洗三次，DAB显色3～10分钟。

12、水洗。

13、苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固。

三、APAAP法

APAAP：属于非标记抗体法，通过具有高特异性的抗碱性磷酸酶抗体，并在抗酶抗体中加入大量的碱性磷酸酶，使碱性磷酸酶充分结合在抗酶抗体上，形成可溶性的APAAP复合物，常用的显色剂为BCIP/NBT、固红或固蓝。特点不会与内源性过氧化物酶反应，所以背景较为干净，特别适合内源性过氧化物酶较多的组织，如肝、肾。

步骤：

1、切片脱蜡至水（冰冻切片或细胞涂片用PBS浸泡3分钟，不需抗原修复）

2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30％ H2O2)室

温20分钟。水洗。

3、抗原修复：（1）pH7.2 TBS 缓冲液洗三次，胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟。或（2）按说明书要求：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟，快速冷却；或(3) 按说明书要求：不处理）

4、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

5、滴加正常血清37 ℃，30分钟。

6、甩去多余血清，适当稀释的特异性抗体，37℃ 60分钟，或4℃过夜。

7、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。

8、桥抗体，37℃ 40分钟或室温1小时。

9、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。

10、滴加适当稀释的APAAP复合物，37℃30分钟。

11、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。

12、滴加AKP底物溶液，37℃ 15――30分钟，阳性结果显现清晰后流水冲洗。

13、复染（核固红或苏木素或甲基绿）1―2分钟，常规冲洗后，甘油明胶封片。

四、 LDP（labelled dextran polymer）法（Envision 二步法）

酶标聚合物法，应用了酶标聚合物技术，如EnVison检测系统，采用了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记在葡萄糖聚合物上，再与二抗连接，形成EnVison二抗；象PowerVision检测系统，采用了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记在氨基酸片段上。由于聚合物上超过20个以上的位点能与一抗结合，聚合物上的酶数量也较多，故较ABC、LSAB等方法更为敏感。最为重要的是，由于LDP系统二抗上没有生物素的存在，不会出现ABC、S-P等方法中出现的与内源性生物素结合的交叉反应，减少了非特异性着色，背景更为干净。

步骤：

1、切片脱蜡至水

2、0.3％H2O2甲醇液：阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30％ H2O2)室温20分钟。自来水洗。

3、抗原修复：（1）pH7.2 TBS缓冲液洗三次，胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟。或（2）按说明书要求：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟，快速冷却；或(3) 按说明书要求：不处理）

4、pH7.2 PBS缓冲液洗三次。

5、滴加正常血清37 ℃，20分钟。

6、甩去多余血清，加一抗，37 ℃，30分钟。

7、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

8、滴加Envision二抗，37 ℃，30分钟。

9、pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。

10、DAB显色3～10分钟。

11、水洗。

12、苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固。

五、双重染色法

1、切片脱蜡至水

2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30％ H2O2)室温

20分钟。 水洗。

3、抗原修复：（1）pH7.2 TBS缓冲液洗三次，胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟。或（2）按说明书要求：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟，快速冷却；或(3) 按说明书要求：不处理）

4、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

5、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用）

6、甩去多余血清，加一抗37 ℃，30分钟。

7、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

8、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。

9、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

10、滴加ABC或S-P复合物（辣根过氧化物酶），37 ℃，45分钟。

11、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

12、DAB（棕色）或AEC（红色）显色3～10分钟。

13、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

14、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用）

15、甩去多余血清，加第二种一抗37 ℃，30分钟。

16、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

17、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。

18、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

19、滴加碱性磷酸酶复合物，37 ℃，30分钟。

20、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。

21、BCIP/NBT显色（蓝色）

22、水洗

23、甲基绿复染，脱水，透明，封固。

如果选择辣根过氧化物酶可选择DAB（棕色）显色，在第21步用辣根过氧化物酶复合物，第23步用AEC（红色）显色，但要注意的是AEC不能长期保存。如选择另一个为碱性磷酸酶可选用BCI/NBT、AP-Red、AP-Orange，用BCI/NBT显色最好。

六、免疫金法（IGS）

（1）切片常规脱蜡入水。

（2）用0.1％胰蛋白酶液消化，37℃ 10-30分钟。

（3）双蒸水洗2次。

（4）0.05 mol/L TBS PH7.4 洗10分钟。

（5）1％卵蛋白封闭10分钟。

（6）滴加特异性一抗，室温2小时或4℃过夜。

（7）0.5 mol/L TBS PH7.4洗3次。

（8）1％ 卵蛋白封闭10分钟。

（9）稀释金标抗体37℃ 45分钟。。

（9）0.05 mol/L TBS PH7.4洗3次。

（10）双蒸水洗2次。

（11）1％戌二醛10分钟。

（12）双蒸水洗3次。

（13）复染、甘油封片、观察。

结果：胶体金结合部位呈红色。

七、免疫金银法（IGSS）

（1）切片常规脱蜡入水。

（2）经含汞固定液固定的组织切片需经0.5％碘酒精脱汞,然后入0.5％硫代硫酸纳水溶液脱碘,流水冲洗,双蒸水洗干净， 0.05 mol/L TBS PH7.4液洗。

（3）用0.1％胰蛋白酶液消化，37℃ 10-30分钟。

（4）0.05 mol/L TBS PH7.4液洗。

（5）1％ 卵蛋白封闭10分钟。

（6）滴加适当稀释的特异性抗体37℃ 1-2小时或4℃过夜。

（7）0.05mol/L TBS PH7.4 液洗3次。

（8）1％ 卵蛋白封闭10分钟。

（9）滴加适当稀释的金标记抗体室温下37℃45分钟。

（10）0.05 mol/L TBS PH7.2 液洗3次。

（11）蒸馏水洗2次，双蒸水洗2次。

（12）入银显影液中3―5分钟,反应过程需避光。

（13）蒸馏水洗。

（14）自来水冲洗，苏木素淡复染。

（15）脱水、透明、封片、观察。

结果：特异性抗体结合部位呈灰黑色颗粒，背景呈清灰色，核呈淡蓝色。

试剂配制：

银显影液：

1、硝酸银显影液：

（1）10％阿拉伯胶水溶液60ml，柠檬酸缓冲液pH3.510ml

（2）对苯二酚1.7g加双蒸水30ml。

（3）硝酸银40mg加双蒸水2ml。

（1）和（2）两液完全溶解混合，临用前加（3），暗处显影。

2、0.05 mol/L TBS (pH7.4)：

Tris 12.1g,

NaCl 17.5g,

双蒸水1900ml,充分搅拌溶解,用浓HCl调pH为7.4,再加双蒸水至2000ml