5-氟尿嘧啶是抗代谢类的化疗药物，它的抗癌作用机制是进入机体内就被活化成氟尿嘧啶脱氧核苷酸，氟尿嘧啶脱氧核苷酸能够抑制胸苷酸合成酶，从而使细胞的DNA的合成受到抑制。此外5-氟尿嘧啶对于细胞的RNA合成也有轻微的抑制作用，从而最终影响了细胞的增殖，对于细胞的DNA合成期的作用最为明显，对细胞周期的其它时相也有一定的抑制作用。通过这些作用机制5-氟尿嘧啶能够发挥其抗癌治疗的作用，临床上主要用于治疗晚期的结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤。
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