结核病诊断方法的新进展

10余年来，结核病的诊断方法在全球范围内得到了很大的发展，一些新的方法在美国、欧洲和其它发达国家已经被批准使用。对于我国这样一个结核病高负担国家，发现病人基本靠常规细菌学检测手段，可能会漏诊许多活动性肺结核病人，造成结核病的播散，加重对社会的危害。我主要讲述的内容是社会对结核病新的诊断方法的需求，常规使用试验及几个有发展前途的试验状况，并且探讨有潜力的可能被使用的诊断方法。

一、对结核病新的诊断方法的需求

由于缺乏一种真正有效的结核疫苗，菌阳肺结核的治疗仍然是结核病控制计划的最重要组成部分。快速而准确的诊断是必需的，不管在发达还是落后国家，比常规方法快速而准确的结核病的诊断方法对控制活动性结核病是一种必然趋势。

在许多地方，由于病人的痰检里发现增长的鸟分枝杆菌复合群体较普遍，因此痰涂片找抗酸杆菌的价值已逐渐降低，肺结核的诊断只是一种可能的诊断，再加上年纪较大的人有咳嗽及异常的胸部X线影像，或者患者是HIV感染者，肺结核的诊断就成立了。这导致了痰涂片在肺结核诊断中特异性的下降，甚至在一些病例中下降至50％。在临床经验中，一个试验具有50％的敏感性及95％的特异性的价值远比具有同样敏感性但特异性仅50％的大。在前一个试验中有10％流动人口诊断的可靠率为53％，反之在第二个试验中可靠率仅为10％，排除诊断的价值分别是94％和50％。

另一方面，一种试验能够快速区分结核分枝杆菌与鸟分枝杆菌复合群，例如用这种设备能够避免卫生部门开始时不必要的接触病人就能发现菌阳患者，并且能将有限的资源分配到更需要的地方使用。在美国和其它国家，广泛使用核酸扩增试验已经发展到一定程度，虽然这些试验尚未被肯定有效，并且这些设备还未被最后通过。

由于缺乏快速而准确的结核病的诊断试验，因此有一笔巨大的支出花在隔离病人和不必要的经验主义治疗上。另外这样的治疗可能由于导致药物副作用而增加开支。

在贫困国家，重点是诊断与治疗菌阳的肺结核病人，主要由于：

第一，由于花费大，分枝杆菌的培养在全世界许多地区不能广泛地开展，诊断主要依靠临床表现、X线和痰涂片检查。第二，痰菌阳性说明传染性的可能大，并且治疗这类病人以减少传染源有重大意义。由于这些条件的限制，当然只能如此，但是痰菌阴性的病人也需要治疗，由于第一，特别是在贫困国家，数量巨大的结核病人为菌阴病例，由于上述原因这些病人毫无疑问的要被误诊，导致病情进展严重(可能会造成永久性损害，例如丧失肺功能)。

第二，虽然痰菌阳性者应该对人群中大多数结核传染负责，但是，近期使用限制性内切酶切片长度多形性(RFLP)研究分析证明痰菌阴性的结核病人也有传染性，并不象人们先前所认为的无传染性，并且传染性随着菌阴病例的增多而加大。这样，不管是针对结核病的个体还是群体，通过对痰菌阳性者的准确诊断是一种有价值的支出。

不管是在资源贫困还是富裕的国家，临床特点(主要是患者的症状和X线表现)能增加结核病的诊断率为50％甚至更多，这些可帮助锁定可疑患者并且进行常规的诊断试验，但是很明显，单靠临床特点不能为结核病的诊断提供可靠的依据。

二、结核病新的诊断实验

1、活动性结核病的诊断实验

分枝杆菌的快速培养系统：值得注意的是比如BACTEC、MGIT、MB/BacT、Septi-check及ESP，当把这些液体系列的培养基与DNA探针结合起来用于快速的菌群鉴定时，大多数痰涂片阳性的标本可在2周甚至更短的时间内得到肯定结果，涂片阴性的标本也只需要不到3周的时间。由于这种方法是目前唯一得到广泛应用的，并且可用来做药敏试验，其价值不可替代。

核酸扩增试验：目前在美国有2种被广泛应用的核酸扩增技术，MTD(Genprobe)和AmPlicor(Roche)，并且MTD主要用于痰菌阴性但临床高度怀疑肺结核病的病例。它为核酸扩增提供恒温的环境，AmPlicor装置则应用PCR技术去倍增一些独特的靶核酸，而这些靶核酸可以用来确定临床标本中的结核杆菌。尽管人们所倍增的靶核酸不尽相同，综合已发表的实验论文，这一系列实验在临床上所起的作用基本上是相同的。对痰涂片阳性的病例，它们几乎均可下出正确的诊断，而对于痰涂片阴性但是培养阳性的病例亦有50％的确诊率。基于其优点，美国FDA一开始就用它来鉴定那些临床可疑病例痰菌是否阳性。

依据核酸扩增试验(NAA)能快速诊断结核病的特点，最近美国胸科学会提出：NAA的最佳运用定位在哪里?而相继发表的NAA试验论文均宣称：以那些可靠的痰菌阳性的病例做参照，它们基本上可以完全检测出这些结核病。同时，论文也指出：此技术应加以推广，它可以比现行的诊断结核病的方法更准确。

在最近的一次实验中，人们将NAA与传统的痰涂片及培养作了比较，它们的特异性相当高，但灵敏度却不大相同，涂片为50％，培养则为100％，尽管NAA的灵敏度为80-84％的水平，但经反复论证，它可以检测出所有菌阳病例，对于涂阴但是培养阳性病例也能诊断出一半。故综合所有病例(真正的阳性及阴性结果)，NAA的灵敏度远远高于涂片，仅略低于培养。一些新的实验报告NAA在诊断涂片阴性肺结核方面亦有独特之处。换句话说，如果有人问：“用NAA能查出我的病人是活动性肺结核吗?”

目前的答案准确率可能是92-95％，而涂片则只能达到80％(有个前提，病人为初治，如果为复治，NAA的准确率将低一些)。实际上，如果实验费用能低一些，NAA可以代替痰涂片来诊断初治肺结核病人。当然，其特异性必然等同或高于现在许多地区应用的抗酸染色涂片法(AFB)。目前，因其费用昂贵(每次试验需50-100美元)，只有那些大型的中心试验室才可以同时快速简便地对大批标本进行检验，NAA才相对经济实用。也有报告建议，当NAA的价位调整至一定水平时，贫困国家也可以使用它。

美国疾病控制预防中心(CDC)推荐将NAA用于诊断活动性结核病，并建议在第一次取痰时就应该行AFB涂片及NAA进行检测。

①如果两者均为阳性，结核病的诊断基本确定。

②如果AFB涂片阳性而NAA阴性，他们建议用抑制剂来抑制标本中可能的结核杆菌分解，尔后重复试验，如果此时NAA TB为阴性，则考虑病人感染了非典型分枝杆菌。

③如果AFB涂片阴性NAA阳性，CDC建议增加送标本的次数，若查处AFB涂片阳性，病人可确诊。

④当AFB涂片及NAA均为阴性时，应加做一次NAA，若仍为阴性，则可排除结核病的诊断。另外还提出，临床工作者决不能忽略相关临床依据，因为最终的诊断仍要依靠疗效及培养的结果。

由此可见，合理地使用NAA来快速诊断肺结核应遵循以下原则：NAA可被用来对那些AFB涂片阳性者作进一步的确诊。如果AFB涂片阴性，临床诊断又高度可疑，应严格采取痰标本行NAA检测，这标本应该是深部咳出的痰或者是通过诱导刺激咳嗽的痰液。虽然用这种方法50％以上AFB涂片阴性但培养阳性者不能做出快速诊断，但对那些AFB涂片阴性的病例，快速诊断率相当高是显而易见的。次方法的可行性已经被FDA在“基因探讨MTD-2实验”中得到了肯定。NAA不能应用在那些AFB涂片阴性而结核病的诊断亦无足够临床依据的病例上。

NAA应用于临床尚有几个问题未解决，过去，痰涂片检查的作用主要是确定患者是否有传染性及疗效分析，但尚无资料显示NAA是否有此能力。尽管有人称若干次不同标本查NAA均为阴性者可基本排除肺结核，但到底要做多少次NAA阴性可完全排除肺结核的诊断仍无据可查。另外，NAA对肺结核的诊断价值无法定论。

NAA阴性不足以排除结核病的诊断，只能说它似乎比涂片检查的灵敏度要高得多，比如说若脑脊液(CSF)标本检查NAA阳性可推测患者患结核性脑膜炎，但对于那些基本达到临床诊断标准的病例，即使NAA阴性也不能排除诊断，所以目前，NAA系列实验仍无法取代标本培养的地位。

2、药物耐药的快速测定

在世界的许多地方，多耐药结核病已成为一个严重的问题，因此，快速药敏实验对结核病的治疗与控制有着很大的意义。大多数情况下，发现利福平耐药足以表明需换二线药抗痨。其方法有检测实际群体而耐药的情况(观察生物体在利福平环境中的存活状态)。其中一种叫“线球分析”的手段，通过检测与耐药有关的rpoB基因的变化来判断而耐药菌，它已经在欧洲创造了不菲的商业利润。

这种方法尤其在比如俄国这些多耐结核病人较多的地方推广使用，而在那些原发耐药问题较严重的地方此方法也很有市场。但是目前为止，因其昂贵的费用(每次检测的价格至少相当于做一次NAA试验)，临床目前尚未使用。

荧光素酶基因报告分析：在这次实验中，一份标本(比如痰)被放入培养基中，午后混入含有荧光素酶的结核杆菌噬菌体，如果痰中有存活的结核杆菌，它们将被吞入噬菌体，此时，荧光素酶基因开始工作，成为游离荧光素发出可见光，然后，将这些含有结核杆菌的标本放在装有抗痨药物的培养基中就可以进行药敏试验了。

尽管次试验最初让人印象深刻，但其临床的进展却一直缓慢。研究者们一直努力地去发现一种技术简便而又经济的方法，以便在经济落后的国家推广使用。此实验目前的版本为BronxBox，使用人造荧光板胶片来显示，记录实验结果，能够在2天内查出活的结核杆菌。

分子信号：一种用分子信号技术来检测结核杆菌的方法被公布，其分子在特定的化学反应时可发光，当具有独特的DNA的引体在PCR反应中卷回自己的靶片段后，这些化学反应便发生了。通过这种方式可作出准确而迅速的诊断，准确性及特异性较高，不仅可用于结核病的诊断，而且在迅速判断抗生素耐药的有关方面亦有效，但是分子信号需要昂贵的设备，所以它无法普及。但是未来用于检测那些传染病的PCR正被临床实验室不断地发展改进，分子信号也将被越来越广泛地得到应用。

3、潜伏期结核病的检测

近来研究检测潜伏期结核菌感染的指导方针集中在检测目标的选择上，只有那些可能将是阳性结果的患者才会被考虑，而另一种更精确判断潜伏感染的方法(与BCG或NTM均无交叉反应)将极大地协助这个战略目标。

外周血单核细胞所产生干扰素的研究：作为对结核菌刺激所做的反应，CD4+及CD8+这些T淋巴细胞能产生具有抗炎作用的γ-干扰素。近来，人们尝试着利用这些免疫反应来诊断结核菌感染。从已确诊的肺结核病人身上抽取分离的外周血单核细胞用来合成PPD，而刺激这些细胞产生的γ-干扰素则可以用ELISA法简单地检测出来，少数研究报告表明此方法能准确地检测潜伏期结核病的感染，与传统的皮试法相比较，不需要病人复诊来询问试验结果，但它的技术更复杂并昂贵。

诊断潜伏期结核病感染由于一直缺乏其金标准而发展受限。起初，用结核菌素刺激所产生γ-干扰素来检测的实验，其对象是很可能已潜伏感染结核病的人，与皮试结果分析，此方法的灵敏度为90％，而特异性则高达98％。另外有研究表明，这种方法可以分辨那些真正的感染者和卡介苗接种者，同时也展示了一些区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的能力。

也可以用早期的“6-抗原(ESAT-6)”来刺激细胞增加IFN的特异性，“6-抗原”是分枝杆菌的产物，包括BCG，可用来区分结核分枝杆菌及其它分枝杆菌。

但是IFN对于诊断潜伏期结核病的作用到底有多大，还需到结核病高发区同时作TST、TFN进行比较，观察到底哪种实验更能准确预测活动性疾病的进展，可行性和可操作性还是个问题。

三、结论

尽管许多新的诊断结核病的技术被开发出来，并且在灵敏度、特异性及统计学的准确性上均优于AFB涂片法，但是真正得到推广的只有一种核酸扩增试验(NAA)。虽然这些新技术较之AFB涂片法在精确度上有了巨大的进步，而且比分枝杆菌培养要节省时间，但较高的投资及设备需求极大地限制了临床的应用，快速药敏试验也是在实验室进行，临床使用也是可行的。但必须再次指出，这些新技术中还没有哪一项可以像目前应用的两种AFB涂片法那样，可以准确评估病人的感染和检测治疗效果。

结核病的新检验技术的发展面临着巨大的挑战，由于高额的费用，即使在相对富裕的国家也难以推广，更何况贫困国家。因此，将来有关诊断潜伏期感染及活动性结核病的新技术，不仅必须有很好的临床实用性，同时也要经济合算。